趙睿婷，周菊，詹達強，田野，張建寧，2，袁恒杰，2

(1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津300052；2天津市神經(jīng)病學研究所)

微粒是細胞受到刺激活化或凋亡過程中產(chǎn)生的直徑為0.1～1.0 μm的囊泡狀結構[1]。微粒具有細胞膜結構及一定量的細胞質，會攜帶來源細胞的特異性表面標志物[2]。1967年Wolf等[3]首次發(fā)現(xiàn)血小板來源的微粒，同時證明血小板來源的微粒富含磷脂，具有促進凝血的作用。隨后越來越多的研究表明，血液中的血小板、白細胞和紅細胞等受到活化或凋亡刺激時均可釋放微粒，不同來源微粒參與細胞的黏附、凋亡、免疫應答、血管重塑、血管生成、止血及血栓生成等過程，與機體生理狀態(tài)的維持及多種疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切[4]。不同血液細胞來源的微粒具有各自特定的功能與作用，微粒的準確測定及不同來源微粒的分離和獲取一直是微粒研究中的難點。本研究擬建立血細胞微粒的制備方法并對方法進行評價，為不同來源的血細胞微粒后續(xù)的基礎功能相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 設備與試劑 流式細胞儀購自美國BD公司。透射電鏡購自日本Hitachi公司。常溫離心機購自美國Beckman Coulter公司。超速離心機購自美國Beckman公司。Megamix標準微粒購自法國Biocyte公司。熒光標準品SPHEROTM Accurate Count Ultra Rainbow Fluorescent Particles(直徑3.8 μm)購自美國spherotech公司。抗體藻紅蛋白(PE)-鈣離子依賴性磷酯結合蛋白V(Annexin V)和細胞表面標記物抗體異硫氰酸熒光素(FITC)-血型糖蛋白A(CD235a)、FITC-白細胞共同抗原(CD45)和FITC-血小板糖蛋白(CD42b)購自美國BD公司。紅細胞裂解液購自中國碧云天試劑公司。

1.2 血細胞微粒的制備方法

1.2.1 血細胞的提取 ①紅細胞的提?。喝? mL枸櫞酸鈉抗凝處理的新鮮健康人全血4 ℃ 150 g離心20 min，取最下層；以無菌PBS溶液重懸，4 ℃ 150 g離心20 min，取最下層，重復此過程3次，洗滌紅細胞，置于-80 ℃冰箱保存，備用。②白細胞的提取：取5 mL枸櫞酸鈉抗凝處理的新鮮健康人全血，按1 mL全血中加入10 mL紅細胞裂解液的比例加入37 ℃預熱的紅細胞裂解液，渦旋混勻；室溫孵育10～15 min，400 g離心5 min；去除上清液，加入10 mL無菌PBS溶液洗滌一次白細胞，如仍有大量紅細胞殘留，重復以上步驟；將所得白細胞置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。③血小板的提?。喝? mL枸櫞酸鈉抗凝處理的新鮮健康人全血，4 ℃ 150 g離心20 min，取上層富含血小板血漿(PRP)；將PRP于4 ℃ 1 500 g離心20 min，沉淀即為血小板，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同血細胞來源微粒的制備 取紅細胞、白細胞、血小板于室溫融化后，加入1 mL無菌PBS溶液，置于組織勻漿器中充分研磨。于4 ℃ 1 500 g離心20 min，取上清。上清液于4 ℃ 13 000 g離心2 min，取上清。上清液置于超高速離心機中，于4 ℃ 10 0000 g離心1 h，沉淀即為紅細胞微粒、白細胞微粒和血小板微粒，用500 μL的無菌PBS溶液重懸。血細胞微粒制備完成后，需用流式細胞儀對微粒的表面標志物及濃度進行測定，以確認微粒是否成功制備。根據(jù)流式細胞儀檢測結果，依需調整微粒的濃度。

1.3 血細胞微粒形態(tài)觀察 采用透射電鏡觀察。將紅細胞微粒、白細胞微粒、血小板微粒的重懸液加入到碳膜/Fomvar膜包被的微柵中，室溫孵育10 min。用濾紙吸掉多余的液體，加入磷鎢酸(pH 6.8)染色5 min以增強膜的可視性。經(jīng)無水乙醇脫水后，置于烘箱烤干，將制好的標本置于透射電鏡下觀察。

1.4 血細胞微粒制備方法的評價

1.4.1 流式細胞技術檢測方法構建及精密度考察 ①確定不同來源血細胞微粒區(qū)域：在流式細胞儀前向散射光(FSC)/側向散射光(SSC)散點圖中，應用Megamix標準微粒(直徑分別為0.5、0.9、3 μm)確定不同大小微粒的位置；根據(jù)不同大小微粒的位置，圈定直徑小于0.9 μm的區(qū)域為微粒區(qū)域。②血細胞表面標志物檢測：向制備的紅細胞微粒、白細胞微粒、血小板微粒標本中加入抗體PE-Annexin V(終濃度為50 ng/μL)，低速震蕩，充分混勻，避光孵育15 min；然后分別向制備的紅細胞微粒、白細胞微粒、血小板微粒標本中依次加入抗體FITC-CD235a、FITC-CD45、FITC-CD42b(終濃度均為10 ng/μL)，混勻后室溫避光孵育30 min，應用流式細胞儀檢測；以圈定的微粒區(qū)域進入下一個散點圖，分析微粒表面磷脂酰絲氨酸和其來源細胞表面標志物表達情況，其中磷脂酰絲氨酸表達以磷脂結合蛋白Annexin V表達來體現(xiàn)；Annexin V的表達以Annexin V+EDTA作為對照管，紅細胞標志物CD235a、白細胞標志物CD45、血小板標志物CD42b在紅細胞微粒、白細胞微粒、血小板微粒表面的表達分別以CD235a、CD45、CD42b的IgG同型對照管作為對照，以此來確定Annexin V、CD235a、CD45、CD42b陽性表達區(qū)域；對雙染抗體樣本檢測前，用對應抗體的單染樣本調整流式細胞儀通道間的熒光補償。③血細胞微粒濃度測定：在一定體積的微粒樣本中加入50 μL的熒光標準品(直徑3.8 μm)，在流式細胞儀上檢測。圈定熒光標準品的區(qū)域，用上述Megamix標準微粒確定樣本微粒區(qū)域。本文50 μL熒光標準品(直徑3.8 μm)中微粒的數(shù)量為50 600個，故樣本的血細胞微粒濃度為：(50 600×樣本微粒區(qū)域的微粒個數(shù))/(熒光標準品區(qū)域微粒個數(shù)×流式檢測所加樣本的體積)。④流式細胞儀檢測方法精密度考察：日內(nèi)相對標準偏差(簡稱日內(nèi)差)：取3份熒光標準品，用流式細胞儀檢測熒光標準品的濃度，連續(xù)測定5次，每隔4 h用流式細胞儀檢測1次，計算日內(nèi)差。日間相對標準偏差(簡稱日間差)：取3份熒光標準品，用流式細胞儀檢測熒光標準品濃度，連續(xù)測定5 d，每隔1 d用流式細胞儀檢測1次，計算其日間差。

1.4.2 血細胞微粒制備方法的重復性及重現(xiàn)性考察 同一天內(nèi)，分5次制備5批不同來源的血細胞微粒，每批制備6個樣本，用流式細胞儀在一天中連續(xù)檢測其表面標志物。隨機抽選30位實驗室工作人員于不同時間按本方法制備血細胞微粒，流式細胞儀觀察血細胞表面標志物的表達情況。以血細胞微粒表面標志物表達的變異度來評估該制備方法的重復性與重現(xiàn)性。

2 結果

2.1 血細胞微粒形態(tài) 在透射電鏡下可以看到，所得紅細胞微粒、白細胞微粒、血小板微粒均為直徑0.1～1.0 μm的不規(guī)則圓形結構，有清晰可見的細胞膜，可看到少許胞質的存在。詳見圖1。

注：A為紅細胞微粒；B為白細胞微粒；C為血小板微粒。

圖1血液細胞微粒形態(tài)

2.2 血細胞微粒表面標志物表達及微粒濃度 流式細胞術檢測結果顯示，紅細胞微粒、白細胞微粒和血小板微粒均具有較強的來源細胞表面標志物表達，表達陽性率均在90%左右。紅細胞微粒、白細胞微粒和血小板微粒均部分表達磷脂酰絲氨酸(見圖2)。流式細胞儀檢測結果顯示，紅細胞微粒、白細胞微粒、血小板微粒濃度分別為(2.2±0.29)×106個/μL、(1.4±0.21)×106個/μL、(1.8±0.31)×106個/μL，相對標準偏差分別為13.2%、15.0%、17.2%。換算至全血來計算，1 mL全血所制得的紅細胞微粒、白細胞微粒和血小板微粒均大于1×108個。

注：A為紅細胞微粒；B為白細胞微粒；C為血小板微粒。

圖2血細胞微粒表面標志物檢測結果

2.3 流式細胞儀檢測方法精密度 3個樣本數(shù)據(jù)的平均日內(nèi)差為4.7%，符合《中國藥典》規(guī)定的對生物樣品檢測相對標準偏差應小于15.0%的要求，見表1。3個樣本數(shù)據(jù)的平均日間差為4.9%，符合《中國藥典》規(guī)定的對生物樣品檢測相對標準偏差應小于15.0%的要求，見表2。

表1 同日內(nèi)5次流式細胞術測得的血細胞微粒熒光標準品濃度及日內(nèi)差

表2 5 d內(nèi)流式細胞術測得的血細胞微粒熒光標準品濃度及日間差

2.4 血細胞微粒制備方法的重復性及重現(xiàn)性 重復性：同一天內(nèi)，分5次制備5批不同的血細胞微粒，每批制備6個樣本，共30個樣本，流式細胞術檢測結果顯示，同日內(nèi)制備的不同批次血細胞微粒表面標志物陽性表達率差異較小(見表3)。重現(xiàn)性：流式細胞術檢測結果顯示，不同實驗室工作人員于不同時間制備的血細胞微粒表面標志物表達陽性率差異較小(見表4)。

表3 同日內(nèi)不同批次制備的血細胞微粒表面標志物陽性表達率

3 討論

雖然細胞微粒起初被認為是細胞代謝廢物，但自20世紀90年代末，其生物學功能逐漸受到學者們的重視。細胞微粒帶有特異性脂類物質，富含來源細胞蛋白質并可能攜帶RNA等生物活性物質，在細胞間的信號通訊過程中發(fā)揮十分重要的作用[5]。細胞微?？梢詤⑴c細胞代謝的調節(jié)、免疫反應、炎癥反應、血管生成和血栓形成過程，與生理狀態(tài)的維持及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4,6,7]。

表4 不同實驗人員制備于不同時間制備的血細胞微粒表面標志物陽性表達率

血細胞來源微粒包括紅細胞微粒、白細胞微粒和血小板微粒。外周血中血小板微粒是血小板活化的標志[8]，在生理性和病理性止血過程中起著重要的作用。血小板微粒的生成極大地擴大了血小板的磷脂表面，提供凝血活化因子Ⅴ的主要結合位點，為凝血酶原轉變?yōu)槟柑峁┝私佑|反應表面[9]。血小板微粒不僅標志著血小板的活化，其自身也有明顯的活化血小板作用。血小板微粒可促進血小板聚集和血栓形成，其數(shù)量及表型變化與心絞痛、心肌梗死等多種疾病密切相關[10]；同時與血管內(nèi)皮細胞、白細胞及黏附分子間有著橋聯(lián)關系，影響人白細胞及血管內(nèi)皮細胞的功能，參與炎癥中的血管損傷過程[11]。研究[12,13]表明，紅細胞來源微粒能促使聚集的趨化因子配體Ⅰ與血小板相互作用，進而刺激血小板釋放α-糖蛋白碎片，增強炎癥反應。白細胞微粒有促炎、促凝和促進血栓生成等多種功能，可與內(nèi)皮細胞表面的黏附分子相互作用，導致內(nèi)皮細胞促炎和促凝活性增強[14]。白細胞微粒也可被活化的血小板所捕捉，通過P-選擇素/P-選擇素糖蛋白配體-1依賴機制，導致組織因子蓄積，促進血栓蔓延。因此，白細胞微粒黏附于血小板成為白細胞微粒參與血栓形成的一個重要機制[15]。雖然大量研究已經(jīng)證明，血細胞微粒水平及生物學特征變化與多種疾病密切相關，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸，但其作用機制尚不清楚。

本研究采用凍融、研磨的方式產(chǎn)生血細胞微粒，將細胞在-80 ℃條件下冰凍，室溫融解，由于細胞內(nèi)冰粒形成和細胞內(nèi)液濃度增高、引起溶脹，使細胞結構破碎。而研磨不僅加劇了細胞結構的破碎程度，也可以使破碎的細胞膜隨機成囊，形成微粒。隨后，在不同的離心條件下梯度除去細胞及較大的碎片；4 ℃ 100 000 g超高速離心，得到血細胞微粒。本方法穩(wěn)定可靠、簡便易行，為后期研究病生理狀態(tài)下機體微粒生成和變化及微粒功能學與作用機制研究提供了方法學依據(jù)。我們利用由0.5、0.9、3 μm組成的混合標準微粒區(qū)分微粒大小，將微粒直徑小于0.9 μm作為細胞微粒判定標準，并用絕對計數(shù)微球計算微粒數(shù)量，提高了微粒定量檢測結果的準確性。所制備的細胞微粒形態(tài)學和表型檢測結果顯示，該方法制備出微粒具有細胞微粒典型的形態(tài)學結構，其來源細胞表面的特異性標志物表達水平較強，部分微粒表達磷脂酰絲氨酸。

迄今為止，細胞微粒的檢測方法主要包括流式細胞術檢測法[16,17]、電子顯微鏡檢測法[16]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[18]及蛋白印記法[7]等。其中，流式細胞術由于具有分析速度快、可同時對檢測對象進行定性及定量分析等特點，已經(jīng)成為細胞微粒最常用的檢測方法。微粒在形成過程中，膜內(nèi)側帶有負電荷的磷脂酰絲氨酸翻轉暴露于膜外[19]，且?guī)в衼碓醇毎谋砻嫣禺愋缘鞍譡20]，故我們選擇磷脂酰絲氨酸和其來源細胞表面標志物檢測來鑒定血細胞微粒。然而并非所有細胞微粒表面都帶有磷脂酰絲氨酸，即不是所有細胞微粒都呈Annexin V陽性，Annexin V陽性僅僅表現(xiàn)為一種血細胞來源微粒的表型特征。本研究中，流式細胞術對熒光標準品的測量結果所得的日內(nèi)差、日間差均符合《中國藥典》對生物樣品檢測相對標準偏差的要求，表明流式細胞術檢測方法有著較高的精密度，適合用于血細胞微粒的檢測。

此外，制備方法的重復性和重現(xiàn)性評價結果顯示，同日內(nèi)制備的不同批次血細胞微粒表面標志物陽性表達率差異較小，不同實驗室工作人員于不同時間制備的血細胞微粒表面標志物表達陽性率差異也較小，說明本血細胞微粒制備方法的重復性和重現(xiàn)性均較好。本文所采用的血細胞微粒檢測方法不僅僅適用于本文所制備的血細胞微粒檢測，也可以作為一種通用的細胞微粒檢測方法，用于不同組織細胞來源微粒的檢測，為相關基礎研究提供了便利。

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