沈嬋娟，鐘永，袁朝暉，胡國瑜

(1株洲市中心醫(yī)院，湖南株洲412000；2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院)

多發(fā)性骨髓瘤是一種好發(fā)于中老年的血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其發(fā)病率約占所有惡性腫瘤的1%，占血液系統(tǒng)腫瘤的10%～15%，近年發(fā)病率逐漸增高且發(fā)病年齡有年輕化趨勢[1]。多發(fā)性骨髓瘤自然病程為6～12個月，接受傳統(tǒng)藥物化療后中位生存期為3～5年。新的靶向藥物如蛋白酶體抑制劑硼替佐米、雷利度胺的出現(xiàn)提高了多發(fā)性骨髓瘤的臨床療效，但總體療效仍不盡人意[2]。因此迫切需要研究更有效的治療手段，如免疫治療等[3]。細胞毒性T細胞17(Tc17)是近年發(fā)現(xiàn)的一類可分泌IL-17的CD8+T細胞亞群[4]。近年研究表明Tc17細胞在小鼠體內(nèi)具有抗腫瘤效應(yīng)[5,6]，但也有文獻報道Tc17細胞在腫瘤免疫逃逸機制中發(fā)揮重要作用[7,8]。髓系來源的抑制性細胞(MDSCs)是近年研究發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫細胞亞群，它可以通過多種途徑抑制機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在炎癥、自身免疫和移植免疫中發(fā)揮重要作用[9]。對于MDSCs與Tc17細胞比例在多發(fā)性骨髓瘤中是否有相關(guān)性尚待進一步研究。為此，我們觀察了多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平的變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年1月～2015年12月株洲市中心醫(yī)院血液科收治的新發(fā)多發(fā)性骨髓瘤患者41例(病例組)；男25例、女16例；年齡31～78歲、中位年齡61歲；按國際分期體系(ISS)進行分期，ISSⅠ期10例、ISSⅡ期16例、ISSⅢ期15例；不合并幽門螺桿菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等細菌病毒感染，無伴發(fā)自身免疫性疾病。選擇健康體檢志愿者19例為正常對照(對照組)，其中男12例、女7例，年齡25～60歲、中位年齡47歲。

1.2 主要試劑 PE-Cy5標(biāo)記的CD3抗體，APC標(biāo)記的鼠抗人CD3抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD8抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD4、CD14抗體，PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體，PE標(biāo)記的鼠抗人CD127、HLA-DR抗體，PE標(biāo)記的IL-17抗體，同型對照APC、PE、FITC、PE-Cy5標(biāo)記的鼠IgG1免疫球蛋白均購自eBioscience公司；細胞因子刺激劑佛波酯(PMA)和離子霉素(Ionomycin)購于Sigma公司；細胞固定-透膜試劑盒、高爾基阻斷劑Golgistop購自BD公司。

1.3 外周血Tc17細胞比例測算 將兩組肝素抗凝血以PBS稀釋后，用Ficoll密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞(PBMC)，調(diào)整細胞密度為106/mL，鋪于平底48孔板，加入50 ng/mL的PMA、1 μg/mL的Ionomycin及Golgistop即用型高爾基體阻斷劑。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)5 h，然后取出細胞測算Tc17細胞比例。

1.4 外周血MDSCs比例測算 取刺激培養(yǎng)后的PBMC，加入CD3、CD8抗體及同型對照抗體，4 ℃避光孵育20 min，流式洗液洗滌2次，加入Fix固定液，4 ℃避光固定30 min，然后Perm/wash通透洗液洗滌2次，再加入胞內(nèi)分子IL-17A抗體及同型對照抗體，4 ℃避光孵育30 min，Perm/wash通透洗液洗滌2次后流式細胞儀測算CD3+CD8+IL-17A+細胞占CD8+T細胞比例。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，調(diào)整細胞密度為107/mL,吸取100 μL細胞懸液加入流式管中，采用CD14、HLA-DR抗體標(biāo)記，同時標(biāo)記同型對照，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，用BD公司生產(chǎn)的Aria流式細胞儀檢測CD14+HLA-DR-/low細胞，此即MDSCs細胞。計算MDSCs占PBMC的比例。

1.5 血漿IL-17檢測 采用ELISA法檢測血漿IL-17。試劑盒購自eBioscience公司。各項操作嚴格按說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Tc17細胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平比較 病例組、對照組外周血Tc17細胞比例分別為3.06%±1.77%、0.75%±0.45%，MDSCs比例分別為6.60%±3.38%、2.53%±0.85%，血漿IL-17水平分別為(45.64±16.93)、(13.10±4.50)pg/mL，病例組外周血Tc17細胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平均高于對照組(P均<0.01)。

2.2 多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞比例與MDSCs比例、血漿IL-17水平的相關(guān)性 41例多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞比例與血漿IL-17水平無相關(guān)性(R=0.30，P>0.05)；Tc17細胞比例與MDSCs比例無相關(guān)性(R=0.160，P>0.05)。

2.3 外周血Tc17細胞比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞比例與患者性別、年齡、ISS分期、LDH水平、血肌酐水平均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。詳見表1。

表1 外周血Tc17細胞比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

2009年，Hamada等[4]在感染流感病毒的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生IL-17的CD8+T細胞亞群，這群細胞在細胞分化和細胞毒性功能上與經(jīng)典細胞毒T細胞存在差異，因此將其定義為Tc17細胞。近年有許多研究報道Tc17細胞在感染和自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[10]。有關(guān)Tc17細胞的分化調(diào)控和可塑性研究多來源于自身免疫性疾病模型，但近年也有研究報道Tc17細胞在人和小鼠腫瘤免疫中發(fā)揮作用。有學(xué)者[5]報道Tc17細胞在小鼠黑色素瘤模型中具有抗腫瘤效應(yīng)，可能和Th17細胞類似，IFN-γ可能是Tc17細胞介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵細胞因子。有學(xué)者[6]將體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤抗原特異性的Tc17細胞回輸至黑色素瘤小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它們可以通過募集中性粒細胞和巨噬細胞富集至腫瘤局部，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，和Tc1細胞一樣具有抗腫瘤作用。在人體腫瘤相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了Tc17細胞可能具有抗腫瘤效應(yīng)。有學(xué)者[11]報道在肺腺癌患者外周血中Tc17細胞比例較正常人降低，手術(shù)后患者外周血Tc17細胞比例較術(shù)前明顯增加。研究[12]報道胃癌患者外周血中Tc17細胞比例較正常對照明顯降低，且Tc17細胞比例與Th17細胞比例呈負相關(guān)。Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者外周血中Tc17細胞比例和絕對數(shù)較正常對照均顯著降低，同時Tc17細胞比例與腫瘤大小呈負相關(guān)。

然而，與以上結(jié)論不同，也有研究者發(fā)現(xiàn)Tc17細胞可能具有促瘤作用：Tsai等[8]發(fā)現(xiàn)頭頸鱗癌患者外周血Tc17細胞比例顯著高于健康對照，同時隨疾病進展、Tc17細胞比例增加，Tc17細胞與調(diào)節(jié)性T細胞比例呈正相關(guān)。Zhuang等[7]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的Tc17細胞比例高于外周血、癌旁組織及正常組織，且與患者預(yù)后呈負相關(guān)，Tc17細胞能促進MDSC細胞的趨化，從而促進腫瘤進展。

早在20多年前已有學(xué)者在小鼠肺癌腫瘤模型發(fā)現(xiàn)了MDSC[14]。近年越來越多的文獻報道顯示，MDSC在腫瘤及多種其他疾病中參與免疫反應(yīng)的負性調(diào)節(jié)。研究[15]報道CD11b+CD14-HLA-DR-CD33+在多發(fā)性骨髓瘤患者中可分離鑒定MDSC。腫瘤細胞和宿主細胞分泌至腫瘤微環(huán)境中的各種細胞因子(如TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13)、趨化因子(如CCL2、CXCL-2、CXCL12)或生長因子(如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、SCF)都能誘導(dǎo)MDSCs的產(chǎn)生[16]。文獻報道[17]多發(fā)性骨髓瘤細胞可表達IL-17R，而Tc17細胞可分泌IL-17，因此我們推測在多發(fā)性骨髓瘤微環(huán)境中Tc17細胞可通過分泌IL-17使多發(fā)性骨髓瘤細胞分泌某些趨化因子，進而募集MDSC細胞發(fā)揮抑制腫瘤免疫的功能，進而實現(xiàn)免疫逃逸。

本研究結(jié)果顯示，病例組外周血Tc17細胞、MDSCs比例和血漿IL-17水平均高于對照組，然而多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞比例與血漿IL-17水平和MDSCs比例無相關(guān)性，提示在多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)，Tc17細胞可能通過分泌產(chǎn)生其他細胞因子間接參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展。進一步分析Tc17細胞比例與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞比例與患者性別、年齡、ISS分期、LDH水平、血肌酐水平均無明顯相關(guān)性，這可能與本研究臨床樣本偏少有關(guān)，我們將進一步擴大樣本量驗證上述結(jié)果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Tc17細胞比例、MDSCs比例及血漿IL-17水平均升高，Tc17細胞比例變化可能與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病有關(guān)，對其相關(guān)機制進行研究有可能為抗腫瘤免疫治療方案的制訂提供新的理論依據(jù)。

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