馬蕓，段文晶，李姝墨，董堅，楊瑩

(1昆明醫(yī)科大學，昆明650500；2昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院；3昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院)

乳腺癌是20～59歲婦女常見的腫瘤相關死亡原因[1,2]。目前臨床上參考分子亞型和免疫組化檢查結果將乳腺癌劃分為Luminal型、HER2陽性型(后簡稱HER2型)及三陰型三種亞型，而不同亞型乳腺癌的分子病理機制、臨床特點、治療方法及預后各不相同。研究發(fā)現(xiàn)有多個范科尼貧血(FA)基因(FA-A、B、C、D1、I、E、F、G、I、J、L、M、N)與乳腺腫瘤易感基因(BRCA)1、BRCA2組成一個復雜的FA/BRCA信號通路，該通路主要調控DNA雙鏈斷裂的同源重組修復，在細胞周期調控、細胞凋亡、基因轉錄與維持基因穩(wěn)定性等過程中也發(fā)揮重要作用[3]。FA/BRCA通路相關蛋白被認為與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等[4]。有學者發(fā)現(xiàn)FA/BRCA通路的過度激活與腫瘤耐藥發(fā)生有關，F(xiàn)A基因表達與惡性腫瘤發(fā)病及放療治療效果關系密切等[5～8]。雖然FA基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用已有報道，但關于FA/BRCA通路相關基因在不同亞型乳腺癌中表達情況的研究較少。本研究觀察了不同亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因的表達差異，以期了解FA/BRCA通路基因表達與乳腺癌分子亞型的關系。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌組織標本來源 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科2013年5月～2017年9月手術切除的女性患者乳腺癌組織標本共93例份，均為浸潤性導管癌，其中直接手術的三陰型乳腺癌、Luminal型乳腺癌、HER2型乳腺癌各20例，行新輔助化療后的三型乳腺癌分別為11、13、9例。除不同分型的新輔助化療患者在生育次數(shù)方面有統(tǒng)計學差異外，其余各組數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學意義(詳見表1)。而生育次數(shù)與乳腺癌的相關性報道較少，因此我們認為各組患者資料具有一定可比性。乳腺癌組織和正常組織(距離腫瘤灶>5 cm)手術取材后立即保存于-80 ℃超低溫冰箱，隨后轉入液氮中凍存，用于后續(xù)檢測。

表1 乳腺癌組織來源患者基本資料比較(M)

1.2 三種亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因檢測 以GAPDH為內參。采用real-time PCR法檢測不同分型乳腺癌組織中的FA/BRCA通路基因(FANCA、FANCD2、FANCF、FANCI、BRCA1、BRCA2)。相關引物序列見表2。總RNA提取按照TRIzol試劑說明書進行。逆轉錄反應參照All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書操作。PCR反應條件：95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，72 ℃ 10 min。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Gaphpad Prism6.0進行統(tǒng)計分析。計量資料多組間比較采用LSD法，兩兩比較采用非配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 直接手術的三種亞型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達情況 對于直接手術的患者，HER2型乳腺癌組織中BRCA1、FANCI、FANCD2基因相對表達量高于對應正常組織，三陰型乳腺癌組織中FANCD2、FANCI基因相對表達量高于相應的正常組織，三陰型、Luminal型、HER2型乳腺癌組織中FANCF基因相對表達量均低于相應正常組織(P均<0.01)；HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因表達量均高于三陰型和Luminal型，Luminal型乳腺癌組織中FANCA基因表達量高于HER2型和三陰型(P均<0.05)。詳見表3。

2.2 新輔助化療的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達情況 新輔助化療后的三陰型乳腺癌組織中除FANCF外其余5個基因表達量均非常低，F(xiàn)ANCD2在乳腺癌組織中的表達水平低于正常組織，Luminal型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1表達水平高于正常組織(P均<0.05)；新輔助化療后的Luminal型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因表達均高于三陰型和HER2型(P均<0.05)。詳見表4。

表2 待測基因引物序列

2.3 直接手術組與新輔助化療組乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較 新輔助化療的三陰型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因表達量低于直接手術者(P均<0.05)。新輔助化療后的三個亞型乳腺癌組織中FANCF的表達水平高于直接手術者(P均<0.05)。詳見表5。

3 討論

大量研究報道FA/BRCA通路蛋白與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療反應、耐藥性產生等有關。Dai等[9]的研究提示FANCL在順鉑誘導的DNA損傷修復過程中扮演了重要角色。BRCA1和BRCA2(FANCD1)已被證實是乳腺癌遺傳易感基因，能夠調控基因轉錄和細胞周期，誘導細胞凋亡，修復DNA損傷并維護基因組的完整性。BRCA1的突變與乳腺癌、卵巢癌的發(fā)生密切相關[10]。體外實驗發(fā)現(xiàn)上調BRCA1表達可提高卵巢癌SKOV-3細胞的順鉑抗性[11]，在乳腺癌HBL100細胞中下調BRCA1表達可增加細胞對順鉑的敏感性[12]。有學者[13]認為RRM1和BRCA1可作為評估肺癌患者預后的指標。

表3 直接手術的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較

表4 新輔助化療的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較

表5 直接手術與新輔助化療的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較

FANCD2和FANCI在DNA修復途徑中處于重要地位，F(xiàn)A/BRCA途徑的核心事件是FANCI-FANCD2(ID)蛋白復合物的單泛素化。研究[14]發(fā)現(xiàn)FANCI蛋白與FANCD2蛋白可形成復合體，該復合體經過泛素化修飾后，被招募到發(fā)生DNA鏈交聯(lián)的位點，與其他分子共同完成修復過程。有學者[15]成功解析了FANCI-FANCD2復合體的晶體結構。我國研究者[16]發(fā)現(xiàn)FANCD2表達與乳腺癌TNM分期呈負相關，認為FANCD2可能參與了乳腺癌的發(fā)生。Komatsu等[17]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中FANCD2表達上調，且FANCD2表達水平較高的患者其腫瘤直徑大，侵襲性強、預后差，F(xiàn)ANCD2表達水平可作為預測治療效果的指標。

FANCF作為FA核心復合體的銜接蛋白，對復合體的正確組裝和穩(wěn)定起重要作用[18]，同時FANCF作為關鍵因子參與FANCD2泛素化激活過程，其功能破壞可引起多種實體腫瘤的發(fā)生。Yao等[19]研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素耐藥的白血病細胞中FANCF和泛素化的FANCD2蛋白表達上調，同時耐藥細胞株與敏感細胞相比，其DNA損傷程度降低，結果提示FA通路蛋白可通過提高DNA損傷修復水平來增加細胞對阿霉素的耐藥性。也有學者[20]認為FANCF是卵巢癌治療中的一個潛在靶點。乳腺癌相關研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-435S中敲低FANCF表達可導致細胞增殖速率減慢，細胞周期紊亂并誘導細胞凋亡，細胞遷移和侵襲能力減弱；此外，F(xiàn)ANCF敲低導致乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性升高，F(xiàn)ANCF可能是乳腺癌治療的潛在靶點[21]。

乳腺癌的分型與腫瘤致病危險因素、疾病進程、預后和治療方案的選擇密切相關。目前普遍認為Luminal型乳腺癌所占比例最高，其次是三陰型，HER2型最少?；颊叩念A后以三陰型最差，其次為HER2型，Luminal型預后最好。研究表明FA/BRCA通路蛋白可能參與了乳腺癌的發(fā)生和耐藥形成，但該通路相關蛋白在不同亞型乳腺癌組織及治療后組織中的表達情況尚不清楚。因此，本研究通過對比觀察3種亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因的表達情況，探討FA/BRCA通路基因在三種乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對于直接手術的患者，HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因相對表達量高于三陰型和Luminal型，提示FA/BRCA通路基因在HER2型乳腺癌與其他兩亞型乳腺癌中作用差異較大。結合臨床上HER2型乳腺癌病例數(shù)最少，我們推測FA/BRCA通路基因可能在HER2型乳腺癌的發(fā)生中有一定作用。新輔助化療后的三陰型乳腺癌組織與正常組織中除FANCF外其余5個基因表達量均非常低，新輔助化療后的Luminal型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因表達均高于三陰型和HER2型。鑒于Luminal型乳腺癌是三種亞型患者中預后效果最好的，提示我們FA/BRCA通路中的BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因高表達可能與Luminal型乳腺癌患者新輔助化療預后有關。新輔助化療后的三陰型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因表達量低于直接手術者，表明新輔助化療在一定程度上影響B(tài)RCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI的表達。新輔助化療后的3種亞型乳腺癌組織中FANCF的表達水平高于直接手術者，提示FANCF在新輔助化療過程中表達上調，這種改變可能與患者對藥物的敏感性變化有關。

綜上所述，三種亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因表達差異性較大；對于直接手術的患者，HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因相對表達量高于三陰型和Luminal型，提示FA/BRCA通路基因在HER2型乳腺癌與其他兩亞型乳腺癌中作用差異較大。新輔助化療后的Luminal型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因表達均高于三陰型和HER2型，提示BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因高表達可能與Luminal型乳腺癌患者新輔助化療預后有關。新輔助化療可在一定程度上影響B(tài)RCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI的表達。FANCF表達改變可能與乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性有關。

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