王 麗 李 強(qiáng) 楊莉莉 李俊毅 邵海峰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心血管一科,齊齊哈爾 161000)

近年來(lái)，以糖尿病為主的代謝綜合征成為影響人類健康的主要慢性疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，預(yù)計(jì)到2030年全球糖尿病患者將達(dá)到4.5億左右，其中糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)的人數(shù)也相當(dāng)可觀[1，2]。糖尿病心肌病是指糖尿病患者在無(wú)其他因素引起心臟異常的情況下出現(xiàn)的心臟能量代謝或結(jié)構(gòu)異常的一類疾病，其病理特征主要為心肌肥大、局灶性壞死和纖維化、小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚等，發(fā)病率和死亡率在糖尿病心臟并發(fā)癥中位于第二位[3]。心肌細(xì)胞的增殖、凋亡廣泛參與DCM等心腦血管疾病的病理生理過(guò)程[4-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵信號(hào)因子、參與蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的結(jié)構(gòu)蛋白[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾XBP1的表達(dá)，探討XBP1對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響和作用機(jī)制，以期為DCM的治療和診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 H9C2心肌細(xì)胞由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fatal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，XBP1 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并鑒定，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8檢測(cè)試劑盒、Annexin V/PI試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)公司Santa Cruz等。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 細(xì)胞培養(yǎng)：心肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，加入10%的FCS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為70%～90%時(shí)使用0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞處理：取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于六孔板上，每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，離心，棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗，每孔加入10 μl脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，細(xì)胞中分別加入siRNA-XBP1(siRNA-XBP1組)、siRNA-NC(對(duì)照組)，以β-actin為內(nèi)參，蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)XBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

高糖干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為4組：低糖對(duì)照組(使用5.5 mmol/L 葡萄糖作用于細(xì)胞，LG組)、高糖刺激組(使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞，HG組)、高糖加siRNA-NC(使用XBP1 siRNA-NC預(yù)處理細(xì)胞24 h，使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞，HG+NC組)、高糖加X(jué)BP1-siRNA組(使用XBP1 siRNA預(yù)處理細(xì)胞24 h，使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞，HG+siRNA)，各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每孔加入100 μl培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/孔，37℃、5%CO2孵育48 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，每組5個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，在450 nm測(cè)定吸光值(OD值)，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 胰酶處理細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心，PBS緩沖液重懸細(xì)胞密度為(5～10)×105個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞置于新的離心管中，加入5 μl膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V)-FITC混合液和10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕振動(dòng)混勻，避光，置于流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達(dá) 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，PBS緩沖液清洗細(xì)胞，離心，取上清，加入預(yù)冷的5 μl磷酸酶抑制劑、5 μl PMSF、1 μl蛋白酶抑制劑，靜置30 min，15 000 r/min離心10 min，上清即為蛋白提取物，BCA法進(jìn)行蛋白定量。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，按照纖維墊-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-纖維墊的順序安裝轉(zhuǎn)印夾層，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下振蕩2 h。加入一抗反應(yīng)液，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜液清洗3次，每次10 min；加入二抗，室溫振蕩2 h，TBST洗膜液清洗3次，每次10 min，反應(yīng)結(jié)束后加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色，室溫反應(yīng)1 min，暗室中曝光1～2 min，分別浸入顯影液和定影液中30 s，試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Quantity One 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，蛋白的相對(duì)含量為目的蛋白OD值/β-actin OD值。

2 結(jié)果

2.1Western blot檢測(cè)XBP1蛋白的表達(dá)量 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中XBP1 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖1、表1所示，對(duì)照組和siRNA-XBP1組細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量分別為(0.859±0.091)、(0.283±0.059)。與對(duì)照組相比，siRNA-XBP1組細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量明顯下降(t=9.199,P<0.05)，說(shuō)明XBP1 siRNA能夠有效降低XBP1的表達(dá)。

2.2CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞的增殖情況如表2所示，LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的存活率分別為(100.25±10.036)%、(60.413±7.526)%、 (62.891±7.796)%、 (80.107±6.058)%；與LG組相比， HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的存活率均顯著降低(t1=5.500,P1=0.005，t2=5.092,P2=0.007，t3=2.976,P3=0.041)；與HG組相比，HG+NC組細(xì)胞的存活率無(wú)顯著差異(t=0.396,P=0.712)，但HG+siRNA組細(xì)胞的存活率明顯升高(t=3.531,P=0.024)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況 各組細(xì)胞的凋亡情況如圖2、表3所示，LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的凋亡率分別為(9.963±1.534)%、(48.563±5.398)%、(46.279±6.243)%、(20.489±3.421)%；與LG組相比，HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高(t1=11.914，P1=0.000，t2=9.784，P2=0.001，t3=4.863,P3=0.008)；與HG組相比，HG+NC組細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著差異(t=0.479,P=0.657)，但HG+siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯降低(t=7.609,P=0.002)。

2.4Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達(dá) 結(jié)果如表4、圖3所示，LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量分別為(0.246±0.051)、(0.859±0.047)、(0.843±0.086)、(0.423±0.072)；C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表達(dá)量分別為(0.195±0.056)、(0.762±0.083)、(0.724±0.060)、(0.480±0.061)；p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，Puma)的表達(dá)量分別為(0.153±0.025)、(0.642±0.051)、(0.651±0.073)、(0.450±0.058)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表達(dá)量分別為(0.134±0.042)、(0.601±0.013)、(0.620±0.042)、(0.306±0.060)。與LG組相比，HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞中XBP1(t1=15.309,P1=0.000，t2=10.342,P2=0.001，t3=3.475,P3=0.026)、CHOP(t1=9.809,P1=0.001，t2=11.164,P2=0.000，t3=5.961,P3=0.004)、Puma(t1=14.912,P1=0.000，t2=11.179,P2=0.000，t3=8.145,P3=0.001)、Caspase-3(t1=18.398,P1=0.000，t2=14.172,P2=0.000，t3=4.068,P3=0.015) 的表達(dá)量均顯著增加；與HG組相比，HG+NC組細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化(t1=0.282,P1=0.791，t2=0.643,P2=0.555，t3=0.175,P3=0.870，t4=0.749,P4=0.796)，但HG+siRNA組細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的表達(dá)量顯著降低(t1=8.783,P1=0.001，t2=4.742,P2=0.009，t3=4.306,P3=0.013，t4=8.323,P4=0.001)。

圖1 siRNA干擾細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量Fig.1 Expression of XBP1 protein in siRNA interfe-ring cells

GroupsExpressionofXBP1proteinControlgroup0.859±0.091siRNA-XBP1group0.283±0.0591)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

表2XBP1siRNA對(duì)高糖處理的心肌細(xì)胞存活率的影響

GroupsSurvivalrate(%)LGgroup100.25±10.036HGgroup60.413±7.5261)HG+NCgroup62.891±7.7961)HG+siRNAgroup80.107±6.0581)2)

Note：Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.

GroupsRateofapoptosis(%)LGgroup9.963±1.534HGgroup48.563±5.3981)HG+NCgroup46.279±6.2431)HG+siRNAgroup20.489±3.4211)2)

Note：Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.

GroupsXBP1CHOPPumaCaspase-3LGgroup0.246±0.0510.195±0.0560.153±0.0250.134±0.042HGgroup0.859±0.0471)0.762±0.0831)0.642±0.0511)0.601±0.0131)HG+NCgroup0.843±0.0861)0.724±0.0601)0.651±0.0731)0.620±0.0421)HG+siRNAgroup0.423±0.0721)2)0.480±0.0611)2)0.450±0.0581)2)0.306±0.0601)2)

Note：Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.

圖3 心肌細(xì)胞XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of XBP1,CHOP,Puma and Caspase-3 proteins in cardiomyocytes

3 討論

糖尿病心肌病已被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的、特異的心肌疾病。在糖尿病各種并發(fā)癥中，細(xì)胞的增殖、凋亡異常將導(dǎo)致心功能嚴(yán)重受損[8]。高血糖癥是誘發(fā)糖尿病并發(fā)心血管疾病的重要因素之一。有研究表明，67.1%的糖尿病并發(fā)心血管患者均伴有血脂異常[9]。因此有必要研究高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)和未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡信號(hào)通路[10]。XBP1是ERS的重要調(diào)節(jié)因子，當(dāng)受到應(yīng)激時(shí)即被活化，激活多條信號(hào)通路發(fā)揮作用[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，激活UPR信號(hào)通路，從而使XBP1被活化轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，調(diào)控UPR下游靶基因及多種信號(hào)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展[12]。研究表明下調(diào)XBP1的表達(dá)量會(huì)導(dǎo)致相關(guān)下游靶基因的表達(dá)量降低，參與新血管生成、能量代謝、細(xì)胞的增殖和凋亡等過(guò)程[13]。在DCM的病程中，高血糖、氧化應(yīng)激等因素均可誘發(fā)ERS和UPR，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡率增加。然而在這一過(guò)程中，XBP1對(duì)心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少。所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾XBP1在高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞的表達(dá)量，觀察其表達(dá)量對(duì)心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示siRNA-XBP1可降低心肌細(xì)胞中XBP1的表達(dá)量；高糖環(huán)境可抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，但XBP1的表達(dá)量降低可緩解高糖促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

CHOP也稱為GADD153，是ERS調(diào)控的凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子之一，當(dāng)發(fā)生ERS反應(yīng)時(shí)，受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，表達(dá)水平增加，從而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞α-細(xì)辛醚處理細(xì)胞時(shí)可激活ERS，調(diào)節(jié)ERS下游靶基因CHOP的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道在心肌細(xì)胞中，CHOP的表達(dá)量升高激活心肌細(xì)胞凋亡途徑抑制其增殖[15]。Puma是促凋亡基因，對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖起重要作用。有研究表明，Puma為CHOP下游靶基因，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[16]。在線粒體內(nèi)膜上，Puma與Bcl-2或者Bax結(jié)合，增強(qiáng)線粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究證明，丙烯醛可提高Puma的表達(dá)量，裂解Bid，從而誘導(dǎo)Caspase-3的活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的剪切酶。

Caspase-3可通過(guò)與底物結(jié)合，降解下游底物，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究報(bào)道當(dāng)機(jī)體受到異常刺激時(shí)，通過(guò)升高Caspase-3的表達(dá)量，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖[18-20]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了siRNA干預(yù)XBP1和高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的含量，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可使XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白表達(dá)量升高，但XBP1表達(dá)量降低可抑制高糖促進(jìn)XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白表達(dá)量升高，且CHOP、Puma的表達(dá)量隨著XBP1的降低而降低，表明高糖環(huán)境下，激活ERS，但XBP1表達(dá)量降低可降低高糖激活ERS的作用，其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控XBP1/CHOP/Puma信號(hào)通路從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。

總之，RNA干擾XBP1的表達(dá)可抑制高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖，防止糖尿病心肌病的惡化，其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)XBP1/CHOP/Puma信號(hào)通路發(fā)揮作用。

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當(dāng)然，女貪官腐敗還有諸多其他動(dòng)機(jī)，例如僥幸心理、補(bǔ)償心理、攀比心理等。筆者認(rèn)為，僥幸心理只是上述投機(jī)心理的別樣稱呼，基于不平衡心理而生的補(bǔ)償心理只是一種自我報(bào)償心理，仍不出“報(bào)償”的范疇，而攀比心理看似 “趨寡”實(shí)為“追風(fēng)”，只是對(duì)“從眾”的表面偏離，仍屬?gòu)谋娦睦淼姆懂?，故于此不再論述?/p>

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