詹 磊 程良斌 蔡 岳

(湖北省中醫(yī)院肝病科，武漢 430060 )

肝癌的死亡率僅次于肺癌[1]，全世界每年有近60萬新增肝癌患者，中國的肝癌發(fā)病率及死亡率均高居世界首位[1,2]。原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的多基因突變、免疫逃避、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路異常等均有關(guān)[2-4]。T淋巴細(xì)胞免疫是機(jī)體對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的主要免疫機(jī)制[2,4]。報(bào)道指出，肝癌細(xì)胞能通過修飾自身表面抗原改變肝癌的微環(huán)境，從而逃避免疫監(jiān)視。程序性死亡蛋白1(Programmed death 1，PD-1)主要由T淋巴細(xì)胞表達(dá)。PD-1通過與PD-L1及PD-L2的結(jié)合傳遞信號(hào)，從而抑制T淋巴細(xì)胞激活，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡[5]。報(bào)道指出，肝癌組織中PD-1/PD-L1的高表達(dá)可抑制CD8陽性T淋巴細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，引起機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)下降[6]。另外，PD-1/PD-L1信號(hào)通路可抑制IL-2與γ干擾素的產(chǎn)生，從而刺激T淋巴細(xì)胞分泌IL-10，抑制T淋巴細(xì)胞活性[7]。PD-1或PD-L1抗體已被應(yīng)用于臨床，并取得了一定的療效。美國FDA已批準(zhǔn)PD-1抗體作為治療黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌的臨床用藥[8]。

COX-2可通過前列腺素途徑在腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮抑制免疫的作用[9]。塞來昔布(Celecoxib)是一種特異性環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的化療及放療增敏治療[10]。近期的研究指出，黑色素瘤中COX-2的表達(dá)與PD-L1呈顯著正相關(guān)[11]。而關(guān)于COX-2能否影響PD-1的功能以及塞來昔布的抗肝癌機(jī)制是否依賴PD-1尚無人報(bào)道。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1資料來源 本次研究共納入2012年2月～2016年6月我院收治的65例行手術(shù)治療的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者作為研究對(duì)象；所有患者中男性58例，女性7例；患者的年齡介于30～72歲之間，平均(50.3±7.6)歲；所有患者HBsAg(乙肝表面抗原)均為陽性；參照2011版原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診療規(guī)范進(jìn)行診斷，所有患者均確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；術(shù)后診斷顯示所有患者的肝癌標(biāo)本均為肝細(xì)胞癌；所有患者均接受核苷酸類似物抗病毒治療，入院后檢測(cè)HBV DNA均為陰性；排除臨床資料不完整的患者；排除長(zhǎng)期營養(yǎng)不良患者；排除長(zhǎng)期臥床患者；排除近期及長(zhǎng)期服用影響機(jī)體免疫藥物患者；排除并發(fā)其他腫瘤患者。另選取15例我院肝膽外科提供的肝臟正常組織標(biāo)本作為對(duì)照；對(duì)照組患者的年齡介于30～48歲之間，平均(45.6±11.9)歲。納入研究的所有患者均告知本次研究的目的及方法，所有患者均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2材料與設(shè)備 主要試劑包括塞來昔布(美國輝瑞公司)，COX-2抗體(美國Santa Cruz公司)，PD-1抗體、CD8抗體(美國Abcam公司)，F(xiàn)oxp3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。流式抗體包括：FITC標(biāo)記的CD8抗體、APC標(biāo)記的CD4抗體、PE標(biāo)記的CD25抗體(美國BioLegend公司)。SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)。小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?。Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher)。PD-1及對(duì)照siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)。BALB/c小鼠購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。H22細(xì)胞(H22-H8D8)購自美國ATCC公司。主要設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad、Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1小鼠模型的建立 從液氮中取出凍存的H22小鼠肝癌細(xì)胞，37℃水浴中迅速復(fù)蘇，用注射器(2 ml)抽取后迅速注入BALB/c雌性小鼠(共10只)腹腔內(nèi)。取接種腫瘤7 d后生長(zhǎng)良好的H22荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，消毒后剪開并剝?nèi)テつw，用無菌注射器(5 ml)穿過腹壁肌層抽取腹水，用PBS液將腫瘤細(xì)胞稀釋至1×107cells/ml。另選取45只BALB/c雌性小鼠，每只背部皮下注射腹水稀釋液0.2 ml。

1.2.2分組及給藥 接種后第2天將H22荷瘤小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、塞來昔布組和PD-1抗體組，每組15只。對(duì)照組小鼠不予任何特殊處理；塞來昔布組小鼠每天以200 mg/kg塞來昔布進(jìn)行灌胃，連續(xù)用藥28 d；PD-1抗體組給予PD-1抗體腹腔注射，100 μl/只，每3天給藥一次，共9次。每隔1天進(jìn)行1次腫瘤大小測(cè)量，測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑(a)與最短徑(b)，按(a×b2/2)公式計(jì)算腫瘤的體積(V)，繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線與小鼠的生存曲線。末次給藥24 h后將所有存活小鼠脫臼處死，用EDTA-K2抗凝劑采血管收集小鼠靜脈血，置于冰盒中保存，取100 μl用于流式細(xì)胞檢測(cè)。完整取出腫瘤組織，多聚甲醛固定，用于病理檢測(cè)及免疫組化染色。

1.2.3免疫組化染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗5 min×3次。采用SP法檢測(cè)COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平。即用10%正常非免疫羊血清37℃孵育60 min，滴加一抗工作液4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察染色陽性細(xì)胞所占百分比。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取100 μl加入抗凝劑的小鼠靜脈血，根據(jù)說明書加入適當(dāng)比例的待測(cè)抗體(CD8、CD4、CD25)，混勻后室溫避光孵育30 min。向每管中加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫避光溶血10 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加1 ml PBS洗滌，1 500 r/min離心3 min，棄上清。加0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，混勻上流式儀檢測(cè)。CD4+CD25+T細(xì)胞即為Treg。

1.2.5小鼠PBMC分離及檢測(cè) 小鼠PBMC的分離嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。將分離的PBMC進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)染PD-1與對(duì)照siRNA，使用100 μmol/L塞來昔布或空白處理各組細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收細(xì)胞樣。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平。

2 結(jié)果

2.1患者的基本信息 研究初期共納入93例HCC患者，其中9例臨床資料不完整，6例長(zhǎng)期營養(yǎng)不良，3例長(zhǎng)期臥床，2例為惡性腫瘤患者，5例有近期服用影響機(jī)體免疫藥物史，3例并發(fā)其他腫瘤。最終65例患者被納入本次研究。所有患者中40例(61.5%)患者的年齡≥50歲；58例(69.8%)為男性。所有患者均為肝硬化及HBsAG陽性患者?；颊叩呐R床病理分級(jí)與分期等情況見表1所示。

2.2肝癌組織COX-2與PD-1的表達(dá)及相關(guān)性分析 對(duì)HCC患者及正常組織標(biāo)本進(jìn)行IHC分析，光密度分析結(jié)果顯示，HCC患者腫瘤組織中COX-2與PD-1的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。Pearson相關(guān)性分析顯示，HCC患者腫瘤組織中COX-2的表達(dá)水平與PD-1呈顯著正相關(guān)(R2=0.673,P<0.001)，見圖1。

2.3小鼠模型的建立與分析 皮下注射H22細(xì)胞后所有小鼠均成功建模。給藥4周后對(duì)照組、塞來昔布組和PD-1抗體組分別有6只、12只和13只存活。塞來昔布、PD-1抗體治療小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線和生存曲線均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，塞來昔布組、PD-1抗體組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線和生存曲線相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IHC與流式分析顯示，塞來昔布能顯著降低腫瘤組織中PD-1的表達(dá)(P<0.001)；塞來昔布與PD-1抗體均能使腫瘤組織及外周血CD8+T細(xì)胞顯著增多(P<0.001)，使Treg細(xì)胞顯著減少(P<0.001)，見圖2、3。

表1患者的基本信息

Tab.1Basicdataofpatients

Parameters[n(%)]Parameters[n(%)]Age≥50y40(61.5)HBsAG65(100.0)Male58(89.2)BCLCstageCirrhosis65(100.0)A17(26.2)Child-PughclassB22(33.8)A27(41.5)C15(23.1)B21(32.3)D11(16.9)C17(26.2)PathologicalgradeAFP(μg/L)Welldifferentiated21(32.3)≥40049(75.4)Moderatelydifferentiated26(40.0)<40016(24.6)Poorlydifferentiated18(27.7)

Note：AFP.alpha-fetoprotein;HBsAG.The hepatitis B surface antigen;BCLC.Barcelona clinic liver cancer.

圖1 肝癌組織中COX-2與PD-1表達(dá)水平及相關(guān)性分析Fig.1 Expression and correlation of COX-2 and PD-1 in the tissue of liver cancerNote:A.Immunohistochemical results of COX-2 and PD-1；B.IOD analysis of IHC staining;C.Correlation analysis.**.P<0.001.

圖2 小鼠模型分析Fig.2 Mice model analysisNote:A.Survival curve;B.Tumor growth curve;C.IOD analysis of IHC staining.**.P<0.001.

圖3 小鼠模型分析Fig.3 Mice model analysisNote:A，B.Results offlow cytometry analysis of peripheral blood.**.P<0.001.

圖4 Western blot檢測(cè)小鼠PBMC中COX-2、PD-1、CD8與Foxp3水平Fig.4 Western blot analysis of COX-2,PD-1,CD8 and Foxp3 level in PBMC

2.4PBMC中COX-2、PD-1、CD8與Foxp3水平檢測(cè) Western blot結(jié)果顯示，塞來昔布能顯著降低小鼠PBMC的COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平，而不影響轉(zhuǎn)染PD-1 siRNA后PBMC的CD8及Foxp3水平，如圖4所示。

3 討論

塞來昔布為非甾體類抗炎藥，能特異性抑制COX-2 的合成，具有特異性強(qiáng)、副作用小的特點(diǎn)。大量臨床、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)分析均證明塞來昔布能針對(duì)多種腫瘤發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤新生血管形成以及預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用[9]。COX-2在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9,10]。臨床數(shù)據(jù)分析表明COX-2的表達(dá)量與腫瘤的大小、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目緊密相關(guān)[11]。報(bào)道指出，COX-2可通過前列腺素途徑在腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮免疫抑制作用[12]。COX-2誘導(dǎo)的地諾前列酮能抑制自然殺傷細(xì)胞活性和T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖，從而降低干擾素γ與IL-2的合成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7,10,13]。

近期的研究指出，使用塞來昔布能有效抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)，降低荷瘤小鼠腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及外周血中的Treg比例[14]。塞來昔布抑制腫瘤生長(zhǎng)可能與其下調(diào)Treg水平及參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。目前尚無報(bào)道對(duì)COX-2抑制劑是通過何種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)Treg水平的研究。

本次研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者腫瘤組織中COX-2與PD-1的表達(dá)水平均顯著高于正常肝臟標(biāo)本。同時(shí)，HCC患者腫瘤組織中COX-2的表達(dá)水平與PD-1呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明COX-2與PD-1可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，同時(shí)，提示這兩種分子之間可能存在一定的聯(lián)系。PD-1和其配體PD-L1、PD-L2是免疫檢查點(diǎn)信號(hào)的重要分子，其介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞識(shí)別與殺傷的重要方式[5,6,15]。PD-1在腫瘤特異性T細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及一些損傷相關(guān)的T細(xì)胞中高表達(dá)，其配體PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)。采用抗PD-1/PD-L1的免疫療法在黑色素瘤、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中均取得了顯著療效。已有文獻(xiàn)指出，在肝炎向肝癌轉(zhuǎn)化過程中PD-1及其配體PD-L1、PD-L2的表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且PD-1、PD-L1與PD-L2均與肝癌細(xì)胞的惡性程度顯著相關(guān)[16]。

本次小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示，塞來昔布與PD-1抗體治療均能顯著改善小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線和生存曲線。另外，塞來昔布與PD-1抗體組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線和生存曲線相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。塞來昔布能顯著降低腫瘤組織中PD-1的表達(dá)；塞來昔布與PD-1抗體均能使腫瘤組織及外周血中Treg細(xì)胞顯著減少，同時(shí)使CD8+T細(xì)胞顯著增多。這些結(jié)果表明塞來昔布的確可以通過影響腫瘤免疫發(fā)揮抗腫瘤的效果，且其調(diào)節(jié)腫瘤免疫的機(jī)制可能與PD-1抗體類似。為了進(jìn)一步研究塞來昔布的作用機(jī)制，我們分離了小鼠PBMC進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，塞來昔布能顯著降低小鼠PBMC的COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平，而對(duì)轉(zhuǎn)染了PD-1 siRNA后的PBMC則不能進(jìn)一步降低CD8及Foxp3水平。

綜上所述，HCC患者腫瘤組織中COX-2與PD-1均顯著增高。塞來昔布能降低PD-1的表達(dá)水平，這可能是其調(diào)節(jié)腫瘤免疫從而發(fā)揮抗肝癌作用的機(jī)制之一。

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