王 萍

(紹興市人民醫(yī)院，紹興 312000)

小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中天然免疫和適應(yīng)性免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)退行性疾病的病理發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用，參與多種神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程，如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病和多發(fā)性硬化癥等[1,2]。HSPA12B 是最近發(fā)現(xiàn)的HSP70 家族的新成員，與該家族其他成員相比較，有著自己特異的結(jié)構(gòu)和功能[3]。在CNS應(yīng)激過程中，HSPA12B發(fā)揮保護(hù)作用，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，維持血腦屏障通透性，減少腦缺血缺氧梗死面積等[4,5]。課題組已報(bào)道了HSPA12B作為炎癥反應(yīng)蛋白在CNS炎癥過程中表達(dá)上調(diào)，參與小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性活化過程[8]。據(jù)報(bào)道，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白kinase B(PI3K/Akt)途徑參與HSPA12B神經(jīng)保護(hù)作用的調(diào)節(jié)[5]。PI3K/Akt信號(hào)通路通過激活下游的NF-κB和GSK-3β/cyclin D1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖[6,7]。本研究旨在評(píng)價(jià)PI3K/Akt途徑在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化過程對(duì)HSPA12B表達(dá)的影響，為探討HSPA12B在CNS炎癥病程中功能的可能調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及來源 HAPI大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞由南通大學(xué)沈勤教授惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco);LPS、TritionX-100(Sigma)。主要抗體抗HSPA12B多克隆抗體(Sigma);Akt、 phosphor-Akt (p-Akt)(Cell Signal);GAPDH、FITC Goat anti rabbit、Hoechst(Santa cruz)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組培養(yǎng) 細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)基(含100 U/ml青霉素、10 μg/ml鏈霉素、10 mmol/L-谷氨酰胺及10%小牛血清)于37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)換成無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為3組：①空白對(duì)照組。②LPS單一刺激組：取LPS終濃度均為0.1 μg/ml，刺激后繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間分別為2、4、6、8、12、24 h。③LY294002預(yù)處理1 h，再用LPS終濃度均為0.1 μg/ml刺激2 h組。

1.2.2Western blot 收獲各組培養(yǎng)細(xì)胞，1 ml 0.01 mol/L 預(yù)冷的 PBS刮下細(xì)胞。4℃，1 000 r/min離心15 min，棄上清。2×SDS蛋白裂解液溶解細(xì)胞沉淀，震蕩混勻后冰浴20 min。沸水煮10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。蛋白質(zhì)行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.6，150 mmol/L NaCl，0.5%Tween 20)洗滌3次，兔抗Ab4112多克隆抗體室溫孵育1 h，4℃過夜，TBST洗滌3次，HRP-標(biāo)記的山羊抗兔抗體室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，用ECL(pierce)進(jìn)行檢測(cè)，柯達(dá)膠片曝光顯影。

1.2.3免疫熒光細(xì)胞化學(xué) HAPI細(xì)胞種到蓋玻片上，貼壁后用1 μg/ml LPS刺激2 h，4%多聚甲醛，室溫固定1 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加封閉血清，室溫2 h。吸去封閉血清，加入一抗混合液：兔抗大鼠Ab4112多克隆抗體(1∶100)，室溫孵育1 h后4℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加入二抗混合液： FITC偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1∶200)，Hoechst(1∶200)，避光，4℃孵育 1 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次。熒光封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中HSPA12B的表達(dá) 用0.1 μg/ml LPS分別作用 0、2、4、6、8、12、24 h。經(jīng)不同時(shí)間刺激，HSPA12B的表達(dá)量不同。刺激2 h 后HSPA12B 蛋白表達(dá)開始增加，8 h后逐漸降至正常水平(見圖1)。

2.2LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中PI3K/Akt的磷酸化 用0.1 μg/ml LPS分別作用 0、 2、 4、6、8、12、24 h。經(jīng)不同時(shí)間刺激，磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表達(dá)量增加。刺激2 h后 p-Akt開始增加，6 h達(dá)到峰值，8 h 后逐漸降至正常水平(見圖2)。

圖1 不同作用時(shí)間的LPS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中HSPA12B蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different stimulation terms of LPS on HSPA12B protein in microgliasNote: *.P<0.05,vs control.

圖2 不同作用時(shí)間的LPS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中Akt磷酸化蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different stimulation terms of LPS on protein levels of phosphorylated Akt in microgliasNote: *.P<0.05,vs control.

圖3PI3K/Akt通路參與了LPS誘導(dǎo)的HSPA12B表達(dá)

Fig.3EffectsofPI3K/AktsignalingpathwayonLPS-inducedHSPA12Bproteinlevelsinmicroglias

Note: A.The effect of PI3K/Akt inhibitor LY294002 on the expression of phosphorylated Akt；B.The effect of LY294002 on the expression of HSPA12B；C.Quantitative analysis of the expressions of phosphorylated Akt and HSPA12B.*.P<0.05,versus the corresponding control；D.Immunocytochemical staining indicated that LY294002 could effectively inhibit the expression of HSPA12B induced by LPS in the cells.bar:10 μm.

2.3PI3K/Akt通路參與調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中HSPA12B的表達(dá) 應(yīng)用PI3K/Akt特異的藥理抑制劑LY294002預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞1 h，再用LPS終濃度均為1 μg/ml刺激2 h組。檢測(cè)PI3K/Akt通路的激活在LPS誘導(dǎo)HSPA12B表達(dá)中的作用。LY294002(10、50 mmol/L)以濃度依賴方式不同程度抑制LPS誘導(dǎo)的HSPA12B的表達(dá)(見圖3A～C)。

免疫熒光染色顯示，應(yīng)用特異的藥理抑制劑LY294002(10 mmol/L)，可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的HSPA12B的表達(dá)增加。上述結(jié)果提示在LPS誘導(dǎo)HSPA12B表達(dá)的過程中，PI3K/Akt通路發(fā)揮了極其重要的作用(見圖3D)。

3 討論

LPS作為小膠質(zhì)細(xì)胞刺激因子，已經(jīng)被大量用來研究AD與PD等病理發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥進(jìn)程，為之后的抗炎治療提供理論依據(jù)。在本研究中，我們報(bào)道了PI3K/Akt途徑參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HSPA12B表達(dá)。 LPS 0.1 μg/ml作用后，HSPA12B在2 h表達(dá)增加，表達(dá)活性最高；同時(shí)Akt的磷酸化水平增強(qiáng)，應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞，顯著抑制了LPS誘導(dǎo)HSPA12B蛋白水平的表達(dá)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是常駐CNS的單核吞噬細(xì)胞家族成員之一，具有免疫和炎癥雙重功能。在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化，通過炎癥放大和神經(jīng)元損失參與CNS神經(jīng)退行性變[9]。HSPA12B 是最近發(fā)現(xiàn)的HSP70 家族的新成員。HSP70在CNS應(yīng)激過程中高表達(dá)，這一現(xiàn)象被認(rèn)為與炎癥過程中HSP70的神經(jīng)元保護(hù)作用密切相關(guān)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道了過表達(dá)HSPA12B，能顯著縮小MCAO引起的腦梗塞面積，顯著減輕海馬神經(jīng)元損傷。在LPS誘導(dǎo)的炎癥過程中，HSPA12B的保護(hù)性作用也得到驗(yàn)證，HSPA12B參與內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，過表達(dá)HSPA12B可以減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，從而保護(hù)心臟功能和抑制炎癥因子的合成[11]。本課題組曾首次報(bào)道HSPA12B 作為炎癥反應(yīng)蛋白參與CNS的炎癥進(jìn)程，參與小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)LPS活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α、IL-1β)的表達(dá)[12]。LPS活化小膠質(zhì)細(xì)胞，PI3K/Akt發(fā)生磷酸化增強(qiáng)。PI3K/Akt信號(hào)通路通過激活下游的NF-κB和GSK-3β/cyclin D1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖。PI3K/Akt途徑參與介導(dǎo)HSPA12B的保護(hù)性作用過程：介導(dǎo)HSPA12B的心臟保護(hù)作用；調(diào)節(jié)HSPA12B誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移；參與HSPA12B在腦缺血損傷中的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦缺血/腦保護(hù)再灌注損傷[13,14]。本研究通過抑制PI3K/Akt通路，檢測(cè)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中HSPA12B表達(dá)的影響。應(yīng)用PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞，LPS誘導(dǎo)的HSPA12B的蛋白表達(dá)受到顯著抑制，細(xì)胞免疫熒光也顯示，細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K/Akt途徑參與調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中HSPA12B的表達(dá)。

綜上所述，HSPA12B作為炎癥反應(yīng)蛋白參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程，PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化中HSPA12B的表達(dá)。這為進(jìn)一步探討HSPA12B在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥過程中的作用及機(jī)制，為CNS神經(jīng)炎癥的治療尋找新的炎癥干預(yù)靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

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