金微微 ，張會慧 ，李 鑫 ，滕志遠 ，張書博，張秀麗，許 楠 ，孫廣玉

（1.東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3. 黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040）

氮素的供應不足是植物生長最普遍的限制因素之一，氮在植物的生命活動中占有重要的地位[1-2]。植物可以利用的氮素形態(tài)主要有硝態(tài)氮（NO3--N）、銨態(tài)氮（NH4+-N）和有機態(tài)氮（如尿素）等[3-4]，但植物體內大多數的氮都是以NO-3-N或NH4+-N的形式吸收的[5]，NO3--N和NH4+-N的性質不同，植物體對不同形態(tài)氮的吸收能力及利用能力也不相同[6]，并且不同氮形態(tài)明顯影響植物的生長及生理特性[7-8]。光亮桉Eucalyptus nitens[9]、美洲山核桃Carya illinoinensis和白云杉Picea glauca[10]等一些樹種對NH4+-N的吸收作用大于NO3--N，但水青岡Fagus longipetiolataSeem和桑樹Morus alba等一些樹種則優(yōu)先選擇吸收NO3--N[11-12]，一些植物在單一NH4+-N下還會表現出銨鹽毒害現象[13]。因此，研究不同植物對不同氮素形態(tài)的生理響應對指導合理施肥具有重要的意義。

目前，關于不同形態(tài)的氮素對木本植物生理特性方面的研究相對農作物還比較薄弱。小黑楊是我國北方常見的造林和綠化樹種[14]，桑樹為南桑北移后我國北方地區(qū)推廣的主要經濟樹種之一，二者均具有極強的抗旱和鹽堿能力[15-16]。除了綠化外，二者在退化生態(tài)地區(qū)均可作為植被恢復的先鋒樹種。在退化生態(tài)地區(qū)土壤中氮缺乏一直是限制植物恢復的重要限制因素之一[17-18]，因此研究二者對不同氮素形態(tài)的生理響應具有重要意義。植物葉片中的氮大部分以酶的形式存在于葉綠體和線粒體中，特別是葉綠體內的氮大約占到總氮量的75%左右[19]，為此，本文中分別研究了不同氮素形態(tài)下小黑楊和桑樹幼苗葉片的光合氣體交換特性、葉綠素熒光特性以及光合能量分配特點，以期為指導退化生態(tài)氮素缺乏地區(qū)植被恢復過程中的樹種合理配置提供理論依據，并為研究樹木的合理施肥提供一些基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

試驗于2012年3—6月在東北林業(yè)大學植物生理學實驗室進行。供試材料為一年生小黑楊和桑樹幼苗，2種材料的株高均為30 cm左右，利用水培方法將2種材料培養(yǎng)于裝有1/2Hoagland完全營養(yǎng)液直徑30 cm、高50 cm的不透光水培養(yǎng)箱內，每水培養(yǎng)箱分別定植5株。用電動氣泵連續(xù)通氣，每3 d更換一次營養(yǎng)液。待水培苗長勢穩(wěn)定后進行不同氮素試驗處理。在1/2Hoagland完全營養(yǎng)液本身提供的NO3--N 濃度為 7.5 mmol·L-1的基礎上（NO3--N處理），將Hoagland完全營養(yǎng)液中的Ca(NO3)2·4H2O以同等氮濃度的(NH4)2SO4進行替換（NH4+-N處理），并將NH4+-N處理中的Ca2+濃度以CaCl2補充到NO3--N處理中的Ca2+濃度水平。待不同氮形態(tài)處理30 d后進行各生理指標的測定。

1.2 參數的測定及其方法

光合氣體交換參數的測定：在環(huán)境溫度23 ℃、相對濕度 75%、CO2濃度 450 μmol·moL-1溫室條件下，利用Li-6400XT光合儀（Licor公司，美國）固定光照強度 1000 μmol·m-2s-1，各處理選擇 3 片（倒數第3或第4）片完全展開葉，測定其凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci）。3次重復。

葉綠素熒光參數的測定：利用暗適應夾對小黑楊和桑樹幼苗葉片進行0.5 h的暗適應，采用便攜式脈沖調制熒光儀FMS-2（Hansatch公司，英國），參照Hu等[20]方法測定PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、潛在光化學活性（Fv/Fo）、實際光化學效率（ФPSⅡ）和電子傳遞速率（ETR）、光化學淬滅系數（qP）和非光化學淬滅（NPQ），并計算PSⅡ反應中心吸收光能分配參數，即：用于光化學反應的量子產額（YPSⅡ）、依賴于類囊體膜兩側質子梯度和葉黃素循環(huán)的量子產額（YNPQ）、基本的熒光量子產額和熱耗散的量子產額（Yf,D）及失活PSⅡ反應中心的熱耗散量子產額（YNF），計算方法參照Hendrickson和Zhou等[21-22]。3次重復。利用FMS-2的內置光源分別測定經0.5 h暗適應后小黑楊和桑樹幼苗葉片的ФPSⅡ、ETR光響應曲線，方法參照張會慧等[23]，FMS-2施加作用光強分別為100、200、400、600、800 和 1200 μmol·m-2s-1， 每個作用光強下作用3 min后測定ФPSⅡ和ETR等數據。

1.3 數據處理方法

運用Excel和DPS（7.05）軟件對測定數據進行統(tǒng)計分析，文中數據為3次重復的平均值±標準差（SE），并采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較不同數據組間的差異。

2 結果與分析

2.1 小黑楊和桑樹幼苗葉片光合氣體交換參數對不同氮素形態(tài)的響應

圖1可以看出，NH4+-N和NO3--N分別作為唯一氮源時，小黑楊幼苗葉片的Pn、Gs、Tr和Ci之間均無明顯差異（P＞0.05），但不同氮形態(tài)下，桑樹幼苗葉片的光合氣體交換參數卻明顯不同，NO3--N處理下桑樹幼苗葉片的Pn、Gs和Tr分別高于NH4+-N處理的38.72%（P＜0.01）、103.70（P＜0.01）和73.33%（P＜0.01），均達極顯著差異水平，但2種氮素形態(tài)處理下桑樹幼苗葉片的Ci卻無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 小黑楊和桑樹幼苗葉片光合氣體交換參數對不同氮素形態(tài)的響應Fig.1 Responses of gas exchange parameters in leaves of Populus simonii×P. nigra and Morus alba seedlings to nitrogen form

2.2 小黑楊和桑樹幼苗葉片葉綠素熒光特性對不同氮素形態(tài)的響應

由圖2可以看出，NO3--N處理下小黑楊幼苗葉片ФPSⅡ、ETR、qP和NPQ分別高于NH4+-N處理的16.24%（P＜0.05）、28.84%（P＜0.01）、20.07%（P＜0.01）和37.88%（P＜0.05），但Fv/Fm和Fv/Fo未達顯著差異水平。桑樹幼苗葉片的各葉綠素熒光參數對2種氮形態(tài)的表現明顯不同，其中NH4+-N處理下桑樹幼苗葉片的Fv/Fm、Fv/Fo、ФPSⅡ、ETR和qP分 別 低 于 NO3--N處理的 10.16%（P＜ 0.01）、42.24%（P＜ 0.01）、55.53%（P＜ 0.01）、63.97%（P＜ 0.01） 和39.33%（P＜0.01），而NPQ卻高于NO3--N處理的100.46%（P＜0.01），均達到極顯著差異水平。

2.3 不同氮形態(tài)下小黑楊和桑樹幼苗葉片葉綠素熒光參數的光響應曲線

由圖3可以看出，隨著光照強度的增加，2種氮形態(tài)下小黑楊和桑樹幼苗葉片的ФPSⅡ均呈降低趨勢，而ETR呈先增加后降低的趨勢。不同光強下NH4+-N處理桑樹幼苗葉片的ФPSⅡ均明顯低于NO3--N 處理。100 ～ 200 μmol·m-2s-1弱光下，2 種氮形態(tài)下桑樹幼苗葉片的ETR之間無明顯差異，隨著光強的增加，桑樹幼苗葉片的ETR之間差異變得明顯，當光強達 800和 1200 μmol·m-2s-1時，NH4+-N處理桑樹幼苗葉片的ETR分別低于NO3--N處理的38.83%和55.30%。

2.4 小黑楊和桑樹幼苗葉片PSⅡ反應中心光能分配參數對不同氮素形態(tài)的響應

由圖4可以看出，2種氮素形態(tài)下小黑楊和桑樹幼苗葉片的PSⅡ反應中心光能分配參數明顯不同，其中小黑楊幼苗葉片PSⅡ反應中心光能分配參數在NO3--N和NH4+-N處理下差異較小，NH4+-N處理下的YPSⅡ低于NO3--N處理的8.19%，Yf,D高于NO3--N處理的7.77%，而YNPQ和YNF無明顯差異。與小黑楊不同，桑樹幼苗葉片PSⅡ反應中心光能分配參數對2種形態(tài)氮的響應明顯不同，其中NH4+-N處理下的YPSⅡ低于NO3--N處理的29.56%，YNPQ和YNF分別高于NO3--N處理的20.35%和9.62%。

3 討 論

圖2 小黑楊和桑樹幼苗葉片葉綠素熒光特性對不同氮素形態(tài)的響應Fig.2 Responses of hlorophyll fl uorescence characteristics in leaves of Populus simonii×P.nigra and Morus alba seedlings to nitrogen forms

圖3 不同氮形態(tài)下小黑楊和桑樹幼苗葉片葉綠素熒光參數的光響應曲線Fig.3 Chlorophyll fl uorescence parameters response to illumination intensity in leaves of Populus simonii×P. nigra and Morus alba seedlings under different nitrogen forms

氮代謝和碳代謝是植物生命活動中最重要的兩大代謝過程，二者常耦聯在一起發(fā)揮作用[24]。光合作用是植物獲取物質和能量的基礎，氮肥的施用除了直接影響植物的生長及代謝過程外，還會影響到植物的光合作用，且不同形態(tài)氮的生理作用明顯不同，有研究發(fā)現鐵核桃Juglans sigillata實生苗在NO3--N處理下的光合色素含量以及凈光合速率明顯低于NH4+-N處理[25]，并且在紅松Pinus koraiensis幼苗的研究中也表現出相似的結果[26]。本試驗結果發(fā)現，小黑楊幼苗葉片的各光合氣體交換參數在NH4+-N和NO3--N處理下均無明顯差異；桑樹幼苗在NO3--N處理下葉片的Pn、Gs和Tr均明顯高于NH4+-N處理，但2種氮處理下桑樹幼苗葉片的Ci卻無顯著差異。說明2種氮源下小黑楊幼苗均能有效利用進行光合作用，而NH4+-N處理下桑樹幼苗葉片的氣孔因素不但限制了CO2進入葉肉細胞，而非氣孔因素中葉肉細胞對CO2的利用能力也明顯降低。這可能是由于當植物以NO3--N為唯一氮源時，若NO3--N量超過體內所需，多余的NO3--N會貯存在液泡中，并不影響植物的其他代謝過程；而以NH4+-N為唯一氮源時，NH4+容易擴散穿過生物膜，使膜去極化，阻礙質子驅動勢的形成，進而影響同化力的形成，從而對CO2的固定產生抑制作用，降低光合速率[27]。以上結果表明在供應NO3--N的條件下桑樹幼苗光合能力強于在供應NH4+-N的條件下。

圖4 小黑楊和桑樹幼苗葉片PSⅡ反應中心光能分配參數對不同氮素形態(tài)的響應Fig.4 Responses of PS Ⅱ energy allocation pathway in leaves of Populus simonii×P.nigra and Morus alba seedlings to nitrogen forms

葉綠素熒光技術可分析植物光合機構的生理功能，目前已經廣泛應用到植物生理學研究的各個方面，它彌補了光合氣體交換參數在光反應研究中的不足。目前已有較多關于氮素形態(tài)對植物PSⅡ熒光特性的研究，張一利[28]發(fā)現相比NO3--N培養(yǎng)的黃瓜植株，NH4+-N處理下黃瓜植株葉片的ФPSⅡ、F′v/F′m以及光化學碎滅系數qP均有顯著下降，但 2種氮素處理下水稻的ФPSⅡ、F′v/F′m、qP均沒有明顯差異。江力等[29]的研究指出，高氮水平下煙葉的光合放氧速率、光合電子傳遞活性都顯著上升；低氮水平下煙草的光合放氧速率、光合電子傳遞活性顯著下降。陳永亮等[30]的研究表明在NO3--N條件下紅松幼苗葉PSⅡ、PSⅠ活性均明顯高于NH4+-N處理。NO3--N處理的向日葵植株ФPSⅡ、qP和ETR都顯著高于NH4+-N處理的植株；而非光化學猝滅系數則明顯低于NH4+-N處理的植株[31]。本試驗結果表明，在NO3--N條件下，小黑楊葉片的ФPSⅡ、ETR、qP顯著高于NH4+-N處理，有利于碳同化力（ATP和NADPH）的生成，但由于光合作用受多種非氣孔因素（如Rubisco活性等）雙重影響，這種增高并未使小黑楊凈光合速率的升高，且在不同光強下小黑楊葉片的ФPSⅡ、ETR、qP在2種氮形態(tài)處理下無明顯差異，同時葉片PSⅡ反應中心光能分配參數在NO3--N、NH4+-N處理間差異較小，并結合2種氮形態(tài)下小黑楊葉片的Fv/Fm、Fv/Fm光能無顯著差異，說明小黑楊在2種氮形態(tài)處理下PSⅡ反應中心的光化學效率相似。與小黑楊在2種不同氮形態(tài)處理條件下的響應不同，在NH4+-N處理下，與NO3--N處理相比，桑樹的Fv/Fm、Fv/Fo、ФPSⅡ、ETR、qP顯著降低，NPQ顯著升高，這表明在NH4+-N處理下桑樹PSⅡ光化學活性降低，而這種降低可能是由于氨毒害作用使光合磷酸化和光合電子傳遞解偶聯[32]，導致ATP的生成減少，碳同化所需的ATP供應進而減少，使碳同化速率減慢，導致碳同化利用的NADPH減少，造成NADPH的累積，沒有充足的NADP+接受光合電子傳遞鏈傳來的電子，光合電子傳遞鏈處于過度還原狀態(tài)。PSⅡ反應中心激發(fā)的電子傳遞受阻，使PSⅡ反應中心關閉，使桑樹葉片PSⅡ的光化學活性降低、過剩激發(fā)能積累增加，促進了桑樹葉片PSⅡ激發(fā)能的非光化學耗散，這與對桑樹PSⅡ反應中心光能分配參數的分析結果一致（YNPQ和YNF明顯增加），導致YPSⅡ明顯減少，而YPSⅡ減少反過來又會進一步減少同化力的形成，使桑樹葉片的光合能力下降。而在桑樹在NO3--N處理下，NO3--N對植物代謝活動不會產生不利影響，同時NO3-還原過程可利用由葉綠體中生成的蘋果酸經雙羧酸運轉器運送到細胞質，再由蘋果酸脫氫酶催化生成的NADH[33]，同時直接利用還原型鐵氧還蛋白（Fdred）傳遞的電子[11]，Fdred向氮代謝分配的能量可以達光化學反應量子產額的20%～25%，在某些植物中甚至高達55%，這有助于增強桑樹對光合激發(fā)電子的利用能力，使光合電子傳遞鏈正常運轉。

4 結 論

在NO3--N、NH4+-N 2種不同的氮形態(tài)處理下，小黑楊光合特性總體無顯著差異；桑樹在NH4+-N處理下，與NO3--N處理相比，PSⅡ光化學活性明顯下降，凈光合速率顯著下降，表明NH4+-N對桑樹可能有毒害作用，NO3--N更有利于桑樹的生長，碳同化受到抑制可能是NH4+-N處理下桑樹凈光合速率下降的主要原因。

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