楊雪梅 ，趙 楊 ，2，朱亞艷 ，陳庭巧，謝維斌

（1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；3.都勻馬鞍山國有林場，貴州 都勻 558000）

馬尾松Pinus massoniana是我國特有的針葉樹種，以其分布廣、適應(yīng)性強、速生、用途廣、材質(zhì)優(yōu)良而成為我國工業(yè)用材極其重要的樹種之一。多年來，育種工作者按照種質(zhì)資源收集與保存、優(yōu)樹選擇、營建種子園、控制授粉、測定與選擇等常規(guī)育種方法進(jìn)行了大量的遺傳改良工作。目前馬尾松的遺傳改良已經(jīng)進(jìn)入到高世代改良階段，在通過人為選擇獲得顯著的遺傳增益的同時，人們也在擔(dān)心馬尾松遺傳多樣性是否降低。近些年來，利用分子標(biāo)記技術(shù)，尤其是SSR和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行馬尾松天然群體遺傳多樣性[1-6]、種子園遺傳多樣性[7-17]、育種群體遺傳多樣性[18-19]等研究，并有大量的研究報道。如馮源恒等[6]研究發(fā)現(xiàn)，廣西馬尾松的天然群體積累了豐富的遺傳變異，遺傳多樣性主要存在于林分內(nèi)，廣西馬尾松第一代育種群體具有較高的遺傳多樣性，來源于人工林的平均有效等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)及觀測雜合度都低于天然林[19]。這些研究結(jié)果為馬尾松遺傳改良提供了很好的指導(dǎo)作用。但是，不同研究者多是針對種子園、天然林等特定群體進(jìn)行研究評價，很少有針對不同改良階段群體遺傳多樣性進(jìn)行對比分析。馬尾松分布范圍廣，在漫長進(jìn)化的過程中，為了適應(yīng)復(fù)雜多樣的自然地理環(huán)境，形成了不同的地理變異群體。早期各省馬尾松遺傳改良基本是按照地域特色、就近取材的原則來進(jìn)行，不同地域馬尾松群體間遺傳背景保持一定的獨立性[1]，且不同省份馬尾松遺傳改良進(jìn)度不同，因此，不同省份針對特定群體進(jìn)行的遺傳多樣性研究成果很難直接應(yīng)用于其它省份的馬尾松遺傳改良工作。

貴州省作為馬尾松重要分布區(qū)之一，因其獨特的位置和地理條件，孕育了遺傳品質(zhì)多樣的馬尾松資源。目前已建立馬尾松種子園4個，優(yōu)樹基因收集區(qū)收集保存優(yōu)良無性系388個，為貴州馬尾松的遺傳改良奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。目前，貴州省馬尾松的育種研究正進(jìn)入高世代改良階段。為了實現(xiàn)可持續(xù)的多世代改良，本研究以ISSR分子標(biāo)記為技術(shù)手段，對貴州省馬尾松主要分布區(qū)天然林群體樣本、貴州省都勻馬尾松種子園（貴州省馬尾松良種主要供種基地）基因收集區(qū)、種子園及子代進(jìn)行遺傳多樣性分析對比，以期為貴州省馬尾松種質(zhì)資源的收集與保存、種子園遺傳管理以及馬尾松多世代育種策略的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在對貴州省馬尾松天然林開展資源調(diào)查的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同氣候，選擇了11個面積不低于20 hm2的天然群體為研究對象（見表1）。根據(jù)林分面積大小隨機選擇7～21個單株，單株間距不少于200 m，12個群體共取樣162個。

貴州都勻馬寨馬尾松1.5代無性系種子園始建于1992年，建園材料多來自貴州省的初選優(yōu)樹，每個無性系隨機選擇單株，共取94個樣本。

貴州都勻馬寨馬尾松良種基地基因收集區(qū)始建于1998年，材料來自貴州省初選優(yōu)樹，嫁接保存，每個無性系隨機選擇1株，取幼嫩針葉作為試驗材料，共取80份。

在種子園結(jié)實盛期子代苗中隨機選擇81個單株，所有試驗材料分別采集嫩葉，硅膠干燥，低溫保存，備用。

1.2 DNA提取與擴增

采用改良的CTAB法提取馬尾松的總DNA。所得DNA經(jīng)過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將樣品稀釋至150 ng/μL，備用。

表1 貴州省馬尾松天然群體主要地理及生態(tài)因子Table 1 The main geographic and ecological factors in natural populations of P. manssoniana in Guizhou province

1.3 引物篩選與PCR擴增

所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的第9套ISSR引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，篩選出15條多態(tài)性引物用于研究，引物序列見表2。 ISSR反應(yīng)體系的總體積為20 μL, 內(nèi)含Taq Polymerase 1 U，1×buffer，0.5 mmol dNTP，模板 DNA 約 150 ng，Primer 1 μmol。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃變性5 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)[94 ℃變性45 s，50～60 ℃（視引物而定）退火45 s，72℃延伸90 s]。最后72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應(yīng)。采用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存，人工讀帶。

1.4 電泳結(jié)果統(tǒng)計與分析

譜帶統(tǒng)計時將具有相同遷移率的擴增片段按0/1系統(tǒng)紀(jì)錄，有帶記為1，無帶記為0，對相同分子量的不考慮帶的強弱；與空白對照反應(yīng)有相同遷移率的帶均視為污染帶，不予記錄。應(yīng)用POPGENE 32軟件分群體對供試材料進(jìn)行遺傳參數(shù)分析，分別計算不同群體多態(tài)位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s (1973)基因多樣性指數(shù) (H)、Shannon信息指數(shù)(I)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性引物篩選

通過對引物進(jìn)行濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等實驗條件進(jìn)行ISSR分析，獲得15條PCR擴增條帶重復(fù)性高、多態(tài)性好、條帶清晰的引物（見表2）。并對11個地區(qū)的馬尾松天然林樣本進(jìn)行ISSR-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到清晰的指紋圖譜（見圖1）。

表2 馬尾松遺傳多樣性分析ISSR引物Table 2 The primers of ISSR on the study genetic diversity of masson pine

圖1 引物846-天然林ISSR-PCR擴增效果Fig. 1 ISSR-PCR of masson pine by Primer 846

2.2 貴州省馬尾松天然群體遺傳多樣性分析

通過對貴州省馬尾松11個天然群體樣本進(jìn)行ISSR分析，15條引物共擴增出110個條帶，基因位點多態(tài)位點百分率變化介于35.45%～92.73%之間，平均值為71.56%。種源內(nèi)觀測等位基因數(shù)變化介于1.3545～1.9273之間，種源間觀測等位基因數(shù)平均值為1.7107。種源內(nèi)有效等位基因數(shù)變化介于1.1783～1.4612之間，種源間有效等位基因數(shù)為1.5601。種源內(nèi)Nei’s基因多樣性的變化介于0.1119～0.2813之間，種源間Nei’s基因多樣性平均值為0.3308。種源內(nèi)Shannon信息指數(shù)的變化介于0.1742～0.4332之間，種源間Shannon信息指數(shù)為0.5002。觀察雜合度偏高，表明群體中雜合體偏多，純合體偏少；群體間基因分化系數(shù)為0.3092，基因流為1.1170。表明貴州省馬尾松天然林不同分布區(qū)的遺傳多樣度雖存在明顯差異，但仍然保持較高的遺傳多樣性水平，其中羅甸、三穗、玉屏、鎮(zhèn)遠(yuǎn)等種源遺傳多樣性較高，而貴陽種源遺傳多樣性相對較低。由于種源間基因交流頻繁，貴州省馬尾松變異主要存在于種源內(nèi)。種源間氣候、土壤等差異，在自然選擇的作用下種源間也有了較大分化。聚類分析結(jié)果（見圖2）表明，天柱和思南兩個種源的遺傳相似度最高，為0.9316。務(wù)川、雷山兩個種源聚為一類，黃平與六枝2個種源聚為一類，其余7個種源的遺傳相似度也比較高。

2.3 都勻馬尾松種子園收集區(qū)遺傳多樣性分析

利用PopGen32軟件對80個馬尾松無性系進(jìn)行遺傳多樣性分析，得到多態(tài)位點率為71.19%；觀測等位基因數(shù)為1.7119，有效等位基因數(shù)為 1.4606，Nei’s基因多樣性指數(shù)為 0.2633，Shannon信息指數(shù)為0.3925。該收集區(qū)遺傳多樣性水平要低于貴州省馬尾松天然群體。

隨著生活方式的改變，我國人群中存在MS的比例逐年增加，目前已報道的我國成人MS的比例為9.8%～17.8%[17]，本研究中合并MS的前列腺癌患者占16.08%，與之前的報道相符。ZHANG等[12]的研究結(jié)果顯示MS和前列腺癌的Gleason評分≥8以及較晚的病理分期有關(guān)。本研究的結(jié)果證實了MS和病理T分期的相關(guān)性，然而，未發(fā)現(xiàn)兩組之間Gleason評分有明顯差異，可能的原因是本研究采用的Gleason評分分組方式與之前的研究不同。為了減少其他臨床終點對結(jié)果的干擾，我們采用競爭風(fēng)險模型評估MS對生化復(fù)發(fā)的影響，結(jié)果顯示合并MS的前列腺癌患者出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)的概率是無MS者的1.86倍。

表3 貴州省馬尾松天然林遺傳多樣性Table 3 The genetic diversity of natural groups of masson pine in Guizhou

圖2 馬尾松天然林聚類圖（UPGMA法）Fig.2 Dengrogram of eleven populations by ISSR

2.4 種子園馬尾松遺傳多樣性分析

通過篩選的15條引物對種子園94個無性系樣本進(jìn)行ISSR-PCR分析，篩選的15條引物擴增的總條帶數(shù)為121條，多態(tài)位點數(shù)為119條，多態(tài)位點比率為98.35%。每條引物擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)目平均為7.93條。條帶片段大小在250～1500 bp之間。Nei’s基因多樣度指數(shù)為0.3625，Shannon信息多樣性指數(shù)為0.5326，表明建園親本的遺傳多樣性水平較高，仍有進(jìn)一步選擇疏伐的空間。

2.5 種子園子代遺傳多樣性分析

通過篩選出的15條多態(tài)性ISSR引物對都勻馬尾松子代測定林81個樣品進(jìn)行PCR擴增，共擴增出120個條帶，其中多態(tài)性位點117個，多態(tài)位點百分率為97.50%，平均多態(tài)位點數(shù)為7.8條。其中觀測等位基因數(shù)平均值為1.9750，有效等位基因數(shù)平均值為1.5454，Nei’s基因多樣性指數(shù)均值為0.3267，Shannon信息指數(shù)均值為0.4946。表明種子園子代仍然存在較高的遺傳多樣性水平，人工選育過程中并沒有導(dǎo)致遺傳范圍變窄。

3 討論與小結(jié)

遺傳多樣性是生物界中最普遍的特征之一，遺傳多樣性的大小決定著物種或種群進(jìn)化潛力和適應(yīng)環(huán)境的能力。有效的種內(nèi)遺傳變異量也決定了物種在育種過程中的改良潛力。天然林資源長期進(jìn)化過程中形成的龐大基因庫，是遺傳基礎(chǔ)比較廣泛的群體，蘊藏著巨大的生產(chǎn)潛力。馬尾松在貴州省廣泛分布，也是貴州省主要造林和用材樹種，本研究利用ISSR分子標(biāo)記對貴州省馬尾松不同群體遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，天然林的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.3308，Shannon信息指數(shù)為0.5002，遺傳多樣性略低于廣西省的馬尾松天然林。由于基因交流頻繁，遺傳多樣性主要存在于種源內(nèi)，在進(jìn)行種質(zhì)資源收集時可以少收集種源，可在遺傳多樣性相對較高的羅甸、三穗、玉屏等種源內(nèi)多收集單株進(jìn)行保存。

同廣西、湖南馬尾松種子園遺傳多樣性相比，貴州都勻馬尾松種子園遺傳多樣性也略低，但同貴州省馬尾松天然林相比，種子園遺傳多樣性有所升高，可能與建園材料的選擇有關(guān)，早期天然林保存較好，種質(zhì)資源豐富，這些天然林在地理上和遺傳上有分化，由各天然林經(jīng)過選擇出的優(yōu)樹數(shù)量較多，建立的種子園便維持較高水平的遺傳多樣性，種子園子代也變異豐富。一般認(rèn)為，在育種過程中加大人工選擇強度有助于改良群體的遺傳增益，同時會存在降低遺傳多樣性的風(fēng)險，造成遺傳資源選擇范圍變窄，嚴(yán)重影響林木繼續(xù)改良的基礎(chǔ)。但本研究結(jié)果與國內(nèi)其它馬尾松種子園研究結(jié)果再次驗證了Wheeler & Jech的觀點[20]，即遺傳學(xué)家們不用擔(dān)心種子園由于群體數(shù)量有限可能導(dǎo)致遺傳多樣性較天然種群低的問題。王鵬良曾對馬尾松無性系種子園連續(xù)3年的子代進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種子園結(jié)實初期子代遺傳多樣性呈逐年上升趨勢，隨著種子園無性系的花粉量增加，子代中一些等位基因的頻率會有所上升，對子代遺傳多樣性的貢獻(xiàn)也逐步變大，子代遺傳多樣性會進(jìn)一步上升，在種子園結(jié)實盛期，子代可能會有更高水平的遺傳多樣性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)該種子園在結(jié)實初期子代遺傳多樣性略低于種子園親本，現(xiàn)在林木郁閉，通風(fēng)透光差，結(jié)實量進(jìn)入衰退期，子代遺傳多樣性也有大幅度下降，需要結(jié)合子代測定、無性系開花結(jié)實習(xí)性等資料對種子園進(jìn)行去劣疏伐，改善光照條件，同時進(jìn)行輔助授粉以提高種子產(chǎn)量和遺傳品質(zhì)。

但該種子園后期營建的基因收集區(qū)由于材料來源于少數(shù)相鄰縣市，遺傳多樣性相對較低，為了長期改良需要，急需繼續(xù)進(jìn)行種質(zhì)資源的收集、保存。

本研究小結(jié)如下：

（1）馬尾松在貴州省分布廣泛，也是貴州省的主要造林樹種之一，馬尾松天然林群體保持較高的遺傳多樣性。由于種源間基因交流頻繁，貴州省馬尾松變異主要存在于種源內(nèi)。貴州省氣候和生態(tài)條件的復(fù)雜多樣性，使得馬尾松種源間遺傳多樣性有了較大差異。

（2）貴州省都勻市馬尾松良種基地1.5代無性系種子園親本是在貴州省境內(nèi)經(jīng)過優(yōu)樹選擇得到，來源廣泛。種子園和子代仍然存在較高的遺傳多樣性水平，人工選育過程中并沒有導(dǎo)致遺傳范圍變窄，種子園還有進(jìn)一步選擇的潛力。

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