姜明輝 西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所，云南　景洪　666100

傣藥對(duì)葉豆葉為豆科植物翅莢決明CassiaalataLinn.的干燥葉，西雙版納傣醫(yī)稱(chēng)“芽拉勐龍” ，其味淡，性寒，入水塔。具有清火解毒，消腫止痛，殺蟲(chóng)止癢之功。用于風(fēng)火水毒過(guò)盛所致的咽喉腫痛，口舌生瘡；疔瘡腫痛，疥癬，濕疹；六淋證出現(xiàn)的尿頻、尿急、尿痛；痔瘡出血；腹瀉，痢疾；骨折[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2]其葉含有金圣草素、山柰酚、槲皮素、5,7,4＇-三羥基二氫黃酮等黃酮類(lèi)成分，標(biāo)準(zhǔn)收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊(cè)·傣族藥)。目前，未見(jiàn)對(duì)葉豆葉山柰酚含量測(cè)定的報(bào)道，按《中國(guó)藥典》2015年版四部通則[3]現(xiàn)建立對(duì)葉豆葉山柰酚含量測(cè)定方法，為對(duì)葉豆葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考方法和依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent高效液相色譜儀(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260 QuatpumpVL)；島津UV-2550紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)；101-EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2材料不同產(chǎn)地的五批藥材于2014年2月至10月分別采自西雙版納州景洪市、勐?？h、勐臘縣。詳見(jiàn)表1。由西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為豆科植物翅莢決明CassiaalataLinn.的干燥葉。

山柰酚對(duì)照品(批號(hào)：110861-201310，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量按93.2%計(jì))。甲醇、乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；水為超純水(自制)。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性考察色譜柱：Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸(22∶78)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：366 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論板數(shù)以山柰酚計(jì)應(yīng)不低于3000。如圖1、2所示。

2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱(chēng)取山柰酚對(duì)照品適量，置于100 mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL含30μg的溶液，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加80%乙醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)45min，放冷，再稱(chēng)定重量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密量取山柰酚對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為376.714 40μg / mL)，配制成濃度分別為376.71440、301.37152、263.70008、207.19292、150.68576、103.59646、75.34288、60.27430、45.20573、30.13715、22.60286、15.06858、10.54800、3.01372μg /mL的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μl ，以進(jìn)樣濃度Y(μg /mL)為橫坐標(biāo)，峰面積X為縱坐標(biāo)，經(jīng)回歸處理，回歸方程：Y=39.522x-15.458，r2=0.9999，試驗(yàn)結(jié)果表明山柰酚在3～200μg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn)取6份對(duì)葉豆葉藥材(西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，批號(hào)：20140831)，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，依次測(cè)定，對(duì)葉豆葉藥材的平均含量為0.148%，RSD為0.36%。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密量取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品液10μL，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣7次，以峰面積值計(jì)算RSD為1.04%，結(jié)果符合要求。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次的供試品溶液(產(chǎn)地：西雙版納州勐臘縣勐侖鎮(zhèn)，批號(hào)：20140831)，在0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得山柰酚峰面積的RSD為1.44%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取具塞錐形瓶6個(gè)，分別精密加入山柰酚對(duì)照品0.40 mg精密稱(chēng)取已知含量的樣品(西雙版納勐臘縣勐侖鎮(zhèn) 批號(hào)：20140831)0.25 g，分別加入上述6個(gè)具塞錐形瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。該分析方法的回收率為97.42%～102.99%，且RSD為1.64%，符合要求。

2.9樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地5批對(duì)葉豆葉，按照上述方法制備供試品溶液，分別測(cè)定西雙版納州內(nèi)5批樣品，按干燥品計(jì)算本品的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同產(chǎn)地對(duì)葉豆葉山柰酚的含量　(n=2)

3　討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取山柰酚對(duì)照品溶液，在190 ～ 400 nm的范圍內(nèi)掃描，結(jié)果山柰酚在365.6 nm、325.10 nm、266.10 nm處有吸收峰。其他條件不變的情況下，根據(jù)山柰酚在二極管陣列檢測(cè)器上得到的紫外吸收光譜圖，366 nm峰面積比325 nm、266 nm峰面積大；分離效果更好。因此確定該方法的測(cè)定波長(zhǎng)為366 nm。

3.2流動(dòng)相的選擇以乙腈-0.1%甲酸(22∶78)、乙腈-0.2%磷酸(32∶68)、甲醇-0.1%甲酸(22∶78)、甲醇-0.4%磷酸(50∶50)、甲醇-0.4%磷酸-四氫呋喃(40∶50∶10)為流動(dòng)相依法測(cè)定，結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸(22∶78)為流動(dòng)相，各組分分離好，基線較穩(wěn)定。

3.3提取條件的考察實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇為溶劑，采用回流提取(提取時(shí)間為60 min、90 min、120 min)、超聲處理(超聲時(shí)間為30 min、45 min、60 min)制備供試品溶液。結(jié)果表明，以80%乙醇為溶媒，超聲處理45 min，對(duì)葉豆葉中山柰酚的溶出量最大。

3.4耐用性試驗(yàn)按《中國(guó)藥典》2015年版第四版通則9101 “藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，考察了不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同生產(chǎn)廠家的色譜柱(依利特 Hypersil ODS2(150×4.6 mm, 5.0 μm)、Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm))、不同檢測(cè)波長(zhǎng)(361 nm、366 nm、371 nm)、不同流速(0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min)，結(jié)果表明，上述因素對(duì)保留時(shí)間有明顯影響，但對(duì)峰面積積分值無(wú)明顯影響，對(duì)被測(cè)成分色譜峰的分離度、拖尾因子無(wú)明顯影響。

綜上，本文建立HPLC法測(cè)定對(duì)葉豆葉中山柰酚的含量方法，同時(shí)測(cè)定了對(duì)西雙版納州景洪市、勐海縣、勐臘縣五個(gè)產(chǎn)地五批對(duì)葉豆葉藥材含量，結(jié)果顯示，各個(gè)產(chǎn)地的含量有差異。此方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，可為對(duì)葉豆葉藥材標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高，提供方法依據(jù)。

[1]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(第三冊(cè))[M].昆明：云南科技出版社，2005：37.

[2]劉安，徐麗珍，鄒忠梅，等.對(duì)葉豆黃酮類(lèi)化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2009，34(7):861-863.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(四部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：374-377.