張 韞 ，趙宗江 ，李 忻 ，張浩軍 ，趙婷婷 ，楊 鑫 ，嚴(yán)美花 ，李 平 ★

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所；北京市免疫炎性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

近年來，在全球范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病率呈持 續(xù)上升的趨勢，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）接近 90%[1]。 過去人們對糖尿病的聚焦點(diǎn)主要在神經(jīng)損害、血管損害、腎損害，然而肝臟作為調(diào)節(jié)血糖最重要的器官，肝功能在糖尿病治療中的作用正被更多關(guān)注[2]。非酒精性脂肪肝 （non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 在T2DM患者中流行比例達(dá)34%，在伴有肥胖的T2DM患者中NAFLD幾乎普遍存在[3]。NAFLD可引起胰島素抵抗、血脂代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物增加等一系列異常情況[4]。中藥黃連以及它的主要成分黃連素在治療糖尿病的研究中受到越來越多的關(guān)注[5]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo) T2DM伴非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠模型，通過觀察黃連素對模型大鼠脂代謝和肝組織抗氧化酶的影響，探討黃連素對肝臟的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠35只，雄性，6周齡，體重160～180g，北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2010-0001。飼養(yǎng)于中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物室（SPF級）。

1.2 藥物與飼料

黃連素：由上海中藥創(chuàng)新研究中心提供。高脂飼料成分：38%脂肪，12%蛋白質(zhì)，50%碳水化合物。由北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。鏈脲佐菌素：美國Sigma公司。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；油紅O染液（Sigma，美國）；脂肪酸合成酶（FAS）抗體（Cell Signaling，美國）；免疫組化檢測試劑盒（基因科技上海有限公司）。Trizol試劑（Invitrogen，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher，美國）；Ultra SYBR Mixture（康為世紀(jì)公司，中國）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)生化分析儀（美國CD-1600）；滑走式切片機(jī)（日本Sakura）；顯微鏡（日本Olympus BX-51）； 圖象采集系統(tǒng) （日本 Olympus DP73）；ABI 7500 熒光定量 PCR 儀（ABI，美國）。

1.4 模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

將雄性Wistar大鼠35只順應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，正常組10只大鼠給予普通飼料，待造模的大鼠25只給予高脂飼料[6]，5周后參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行胰島素鉗夾實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)出現(xiàn)胰島素抵抗后，參照文獻(xiàn)[8]以25mg/kg的劑量腹腔注射1%的STZ（pH4.2～4.5的0.1M檸檬酸緩沖液配制），72h后測定空腹血糖＞11.1mM視為造模成功。將成模動(dòng)物20只隨機(jī)分為模型組10只和黃連素組10只。黃連素組予25mg/kg/d黃連素[9]，混懸于雙蒸水中。正常組與模型組給予等體積雙蒸水灌胃。各組動(dòng)物灌胃給藥1次/d，連續(xù)給藥20周。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 一般情況觀察

每周密切觀察動(dòng)物精神狀態(tài)、反應(yīng)性、毛發(fā)色澤、飲食及排泄?fàn)顩r。20周時(shí)取材稱量并記錄體重、肝重，計(jì)算肝重指數(shù)。肝重指數(shù)=肝重/體重×100%。

1.5.2 血生化指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹腔注射水合氯醛麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹主動(dòng)脈取血，4℃，3000rpm離心15min，取血清檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量。

1.5.3 肝組織 SOD、CAT、GPX、TC和TG的測定

取肝組織，稱重，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2500rpm離心10min，取上清，按照南京建成生物工程研究所試劑盒操說明書進(jìn)行操作。

1.5.4 肝臟組織病理形態(tài)觀察

經(jīng)HE染色，400倍光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，按照文獻(xiàn)[10]對肝臟脂變程度及炎癥進(jìn)行半定量分析。

肝臟冰凍切片油紅O染色后，400倍顯微鏡下觀察肝臟脂滴沉積的變化。

表1 引物序列

1.5.5 肝組織中FAS的表達(dá)

采用免疫組化法檢測，顯微鏡下觀察并使用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

1.5.6 肝臟組織CAT、GPX1及FAS mRNA表達(dá)

按照試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，Q-PCR）。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用One-way ANOVA，再用S-N-K進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對模型大鼠狀態(tài)及肝重指數(shù)的影響

正常對照組大鼠健康狀態(tài)良好，進(jìn)食、飲水均正常，糞便成形，毛色光澤；模型組大鼠食量增加、飲水增加、尿量增多、活動(dòng)減少、精神稍萎靡、被毛蓬松無光澤；黃連素組較模型組大鼠狀態(tài)有所改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材時(shí)，模型組大鼠肝重指數(shù)顯著高于正常對照組（P＜0.01），黃連素組大鼠的肝重指數(shù)較模型組顯著改善（P＜0.01），結(jié)果見表2。

2.2 黃連素對模型大鼠肝功能、血脂的影響

表3示，與正常組比較，模型組肝功ALT、AST水平均顯著升高，血脂TC、TG和LDL-C水平也顯著升高。 與模型組相比，黃連素組肝功ALT、AST水平降低，血脂TC、TG和LDL-C水平顯著降低。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝重指數(shù)（±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝重指數(shù)（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 黃連素對模型組大鼠肝臟組織抗氧化能力及脂質(zhì)水平的影響

機(jī)體的SOD、CAT、GPX含量是評價(jià)其抗氧化能力的重要指標(biāo)。表4示，與正常對照組相比，模型組 SOD、CAT及GPX活顯著降低；同時(shí)，模型組肝組織中的TC、TG含量顯著升高。黃連素組各抗氧化指標(biāo)及肝臟中TC、TG含量較模型組均有不同程度的改善，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 黃連素對模型大鼠肝組織病理改變的影響

HE染色結(jié)果（圖1見封底）顯示，正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯，肝細(xì)胞無變性。模型組大鼠肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不等的圓形脂滴，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，小葉內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤。黃連素組肝臟脂肪變性程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤及壞死灶減少。此外，油紅O染色（圖1見封底）顯示正常組大鼠肝臟組織細(xì)胞幾乎無脂肪滴，而模型組大鼠肝臟組織分布大量脂肪滴和空泡，脂肪變性程度嚴(yán)重，油紅O陽性著色面積顯著增加。給予黃連素治療的大鼠肝臟脂質(zhì)沉積顯著下降，空泡減少，油紅O陽性著色面積顯著減少。肝臟脂肪變性及炎癥評分結(jié)果見圖2。

2.5 黃連素對模型大鼠肝臟組織中FAS的表達(dá)的影響

免疫組化檢測結(jié)果（圖3見封底）顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝臟組織中FAS高度表達(dá)，提示其肝臟合成脂肪酸的能力較強(qiáng)；給予黃連素治療后FAS表達(dá)顯著下降。FAS免疫組化染色陽性率半定量分析[9]結(jié)果見圖4。

表3 各組大鼠血清學(xué)檢測指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠血清學(xué)檢測指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n ALT（IU/L） AST（IU/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） LDL-C（mmol/L）正常組 10 58.80±20.36 160.5±35.88 2.15±0.33 0.42±0.29 0.51±0.10模型組 10 195.6±75.33## 210.40±55.11# 5.62±3.26## 1.23±0.53## 3.96±2.30##黃連素組 10 129.70±47.33* 165.8±54.76* 2.65±1.16* 0.63±0.39** 1.63±0.71**

表4 各組大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及脂質(zhì)水平的比較（±s）

表4 各組大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及脂質(zhì)水平的比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n SOD（U/mgprot） CAT（U/mgprot） GPX （U/mgprot） TC（mmol/mgprot） TG（mmol/mgprot）正常組 10 252.12±19.61 10.70±2.34 402.16±46.45 144.62±28.81 15.74±2.81模型組 10 218.445±31.59# 7.17±1.09## 309.63±62.84## 179.86±23.41# 22.10±3.61##黃連素組 10 253.46±40.71* 10.61±2.85** 378.74±45.64* 136.06±45.80* 17.96±4.03*

圖2 各組大鼠NAFLD脂肪變性及炎癥評分

圖4 各組大鼠FAS免疫組化染色陽性率半定量分析

圖5 大鼠肝臟組織中CAT、GPX 1及FAS的表達(dá)

2.6 黃連素對模型大鼠肝臟組織CAT、GPX1及FAS mRNA表達(dá)的影響

模型組大鼠肝臟組織CAT和GPX1的mRNA水平顯著低于正常組大鼠，而黃連素可升高CAT和GPX1的mRNA水平；與免疫組化FAS的表達(dá)結(jié)果相一致，模型組大鼠肝臟組織FAS的mRNA水平顯著高于正常組，給予黃連素治療后可降低其表達(dá)水平，具體結(jié)果見圖5。

3 討論

糖尿病是一組由遺傳以及環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的代謝性疾病，其肝臟病變主要表現(xiàn)為NAFLD，比較公認(rèn)的病理機(jī)制是 “二次打擊學(xué)說”，指在胰島素抵抗的狀態(tài)下，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積；各種致病因素引發(fā)的氧化應(yīng)激使反應(yīng)性活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化伴線粒體損傷，肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死[9]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及氧化應(yīng)激失平衡是NAFLD疾病發(fā)生發(fā)展的主要病理機(jī)制。有研究表明，NAFLD增強(qiáng)了T2DM面臨的風(fēng)險(xiǎn)，并會(huì)惡化糖尿病患者的血糖控制和心血管疾病。因此臨床在治療T2DM合并NAFLD時(shí)，所選用的藥物應(yīng)對肝臟有保護(hù)作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量STZ制備T2DM合并NAFLD，實(shí)驗(yàn)中大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體重下降等臨床表現(xiàn)，并有肝功和血脂異常。主要表現(xiàn)為 ALT、AST、TC、TG和LDL-C明顯升高。光鏡下觀察肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞體積明顯增大，胞內(nèi)見大量脂滴，核偏向，炎細(xì)胞浸潤等，油紅O染色可發(fā)現(xiàn)陽性面積增大，表明實(shí)驗(yàn)組大鼠已出現(xiàn)肝臟病變，主要表現(xiàn)為脂肪肝。給予黃連素治療的大鼠，以上指標(biāo)均有顯著改善，表明黃連素對T2DM大鼠的肝損傷與脂質(zhì)異常沉積具有顯著的保護(hù)作用。

脂質(zhì)異常沉積是導(dǎo)致NAFLD的主要方面之一。肝內(nèi)脂肪沉積本身可誘發(fā)IR，同時(shí)IR通過促使外周脂肪分解增加，使得游離脂肪酸產(chǎn)生過多，脂質(zhì)外溢流入肝臟而造成肝臟異位脂質(zhì)沉積[11]。FAS是參與脂肪酸合成的主要酶系之一，其表達(dá)升高可增加脂肪酸的水平，加重肝臟的脂質(zhì)沉積，產(chǎn)生脂代謝紊亂。IR與肝臟脂質(zhì)沉積又互為因果，彼此相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。故打破這一惡性循環(huán)，將有助于整個(gè)代謝紊亂的改善。在本研究免疫組化實(shí)驗(yàn)中，模型組與正常組大鼠肝組織相比FAS呈高表達(dá)，其FAS基因的mRNA表達(dá)也顯著升高。經(jīng)黃連素干預(yù)后，其肝組織FAS的表達(dá)與模型組相比有所降低，F(xiàn)AS基因的mRNA表達(dá)也有所降低。提示黃連素改善T2DM大鼠的肝組織脂代謝紊亂與抑制FAS，減少脂質(zhì)合成有關(guān)。

隨著脂質(zhì)沉積所引發(fā)的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化是推動(dòng)NAFLD進(jìn)展的重要因素[12，13]。有研究表明肝組織細(xì)胞可以表達(dá)抗氧化酶類CAT、SOD和GPX[14]。正常生理情況下，CAT、SOD和GPX可清除ROS，維持細(xì)胞處于氧化還原自穩(wěn)態(tài)。當(dāng)某些因素作用于細(xì)胞使這一穩(wěn)態(tài)失調(diào)，ROS產(chǎn)生的速率大于清除的速率時(shí)，就會(huì)造成 ROS的蓄積，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷[15]。本研究顯示，模型組大鼠肝臟SOD、CAT和GPX活性下降，表明T2DM肝組織存在著明顯的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化和抗氧化能力降低。黃連素干預(yù)后，其肝臟組織中SOD、CAT和GPX活性與模型組相比有所升高。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示模型組抗氧化基因CAT和GPX1的表達(dá)均顯著下降，而黃連素組可上調(diào)其表達(dá)，說明黃連素通過調(diào)節(jié)多種抗氧化酶類的表達(dá)與活性，減輕氧化應(yīng)激，從而改善了肝損傷。

糖尿病非酒精性脂肪肝根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸屬為中醫(yī) “消渴”、“肝著”、“積聚”、“脅痛”范疇。T2DM伴發(fā)NAFLD為多虛多瘀之證，中醫(yī)認(rèn)為脂肪屬于膏脂，在脂肪肝發(fā)病過程中，肝脾失調(diào)、濕熱中阻、津血膏脂代謝失常，引起濕熱與痰濁相互膠結(jié)為患[16]。ROS、MDA等氧化代謝產(chǎn)物與濕熱痰濁密切相關(guān)，濕邪其性黏滯重濁，是體內(nèi)臟腑功能失調(diào)、氣機(jī)紊亂的病理性產(chǎn)物。痰是機(jī)體物質(zhì)代謝失調(diào)生成并積累的各種病理性生化物質(zhì)，因此濕熱痰濁等病理因素與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)意義上的氧化應(yīng)激產(chǎn)物存在一致性。黃連素又稱小檗堿，是一種常見的異喹啉類生物堿，主要從黃連和黃柏等傳統(tǒng)中藥中提取，具有清熱燥濕的功效[17]。黃連素對濕熱蘊(yùn)結(jié)為主證的NAFLD效果顯著，本實(shí)驗(yàn)為其清熱燥濕功效提供了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，本研究證實(shí)黃連素對T2DM大鼠伴發(fā)NAFLD具有明確的肝保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過改善脂代謝相關(guān)分子及抗氧化酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

圖1 各組大鼠病理結(jié)果(×400),A-C為 HE染色，D-F為油紅O染色。A：正常組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯，肝細(xì)胞無變性。B：模型組大鼠肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿大量大小不等的圓形脂滴，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，小葉內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤。C：黃連素組肝臟脂肪變性程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤及壞死灶減少。D：油紅O染色顯示正常組大鼠肝臟組織細(xì)胞幾乎無脂肪滴。E: 模型組大鼠肝臟組織分布大量脂肪滴和空泡，脂肪變性程度嚴(yán)重，油紅O陽性著色面積顯著增加。F:黃連素組油紅O陽性著色面積顯著減少。

圖3 各組大鼠FAS免疫組化染色(×400),A：正常組；B：模型組；C：黃連素組。與正常組大鼠肝臟組織比較，模型組肝臟組織中FAS高度表達(dá)；給予黃連素治療后FAS表達(dá)有顯著下降。

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