楊衛(wèi)平 許陽(yáng) 胡博華 董有毅 楊仕明

1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，耳鼻咽喉研究所（北京100853）

2解放軍總醫(yī)院呼吸科（北京100853）

3美國(guó)紐約州立布法羅大學(xué)聽(tīng)力及聾病研究中心(NY14214USA）

噪聲性聾是一種最常見(jiàn)的感音神經(jīng)性聾，由于交流障礙極大的影響了患者的生活質(zhì)量。噪聲性耳蝸損傷是由耳蝸內(nèi)組織機(jī)械性損傷引起的多方面反應(yīng)，包括氧化反應(yīng)、炎性反應(yīng)、能量代謝障礙等導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞生物和分子的變化。最新研究通過(guò)對(duì)噪聲暴露后小鼠和大鼠耳蝸感覺(jué)上皮相關(guān)基因RNA序列變化，及對(duì)差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄序列生物信息分析后發(fā)現(xiàn)，免疫和炎性反應(yīng)是噪聲暴露后耳蝸的主要反應(yīng)[1]。

由于血腦、血迷路屏障的存在，內(nèi)耳曾被認(rèn)為是一個(gè)“免疫豁免器官”。近年來(lái)研究證明，內(nèi)耳具有免疫應(yīng)答，免疫防疫和免疫調(diào)節(jié)功能[2-4]。Corti器位于耳蝸基底膜的頂部，由感覺(jué)細(xì)胞（內(nèi)、外毛細(xì)胞）和支持細(xì)胞構(gòu)成，Corti器的感覺(jué)細(xì)胞對(duì)噪聲等損傷因素最為敏感[5]。在生理狀態(tài)下耳蝸Corti器缺少免疫細(xì)胞，噪聲暴露后未見(jiàn)單核細(xì)胞滲入Cor?ti器[6]。耳蝸基底膜底部最接近Corti器，是否由耳蝸基底膜底部的免疫細(xì)胞對(duì)Corti器損傷的感覺(jué)細(xì)胞起到免疫監(jiān)視作用？鑒于噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫反應(yīng)問(wèn)題，我們采用白細(xì)胞共同抗原(CD45)熒光免疫抗體標(biāo)記耳蝸基底膜免疫細(xì)胞，觀察噪聲暴露前后耳蝸基底膜底部的免疫細(xì)胞形態(tài)的變化，為揭示噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫反應(yīng)機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

入選C57BL/6J小鼠（24只，4-8周，雌雄各半），購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME,USA）。動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，接觸噪聲暴露動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)組，噪聲暴露后1、4和10天處死小鼠各6只，未接觸噪聲暴露動(dòng)物6只為對(duì)照組。動(dòng)物均無(wú)強(qiáng)噪聲暴露和耳毒性藥物使用史，所有實(shí)驗(yàn)程序均符合美國(guó)紐約州立布法羅大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的倫理認(rèn)證。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首先接受聽(tīng)力學(xué)基線評(píng)估。噪聲暴露1天、4天和10天后處死動(dòng)物,觀察噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫細(xì)胞的變化。噪聲暴露10天組動(dòng)物處死之前檢測(cè)ABR，定量觀察耳蝸毛細(xì)胞缺失數(shù)量，目的評(píng)估噪聲暴露后耳蝸聽(tīng)功能和感覺(jué)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.3 腦干誘發(fā)電位反應(yīng)閾值(ABR)測(cè)試

動(dòng)物于噪聲暴露前及噪聲暴露后10天，腹腔內(nèi)注射氯胺酮（87mg/kg）和賽拉嗪（3mg/kg）混合劑麻醉后，將動(dòng)物置于加熱毯上維持體溫在37.5℃。記錄電極置于動(dòng)物顱頂皮下，參考電極和接地電極分別置于測(cè)試耳和對(duì)側(cè)耳后皮下。應(yīng)用電位反應(yīng)測(cè)聽(tīng)儀（SigGen,Turker-Davis Technologies,TDT,Alachua,FL,USA)檢測(cè)不同頻率（4、8、16和 32 kHz）短聲誘發(fā)的動(dòng)物雙耳聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值（ABR），刺激重復(fù)率21次/秒。帶通濾波100～3000Hz，刺激強(qiáng)度為20 ～100 dBSPL，間隔 5 dB。

1.4 噪聲暴露

噪聲信號(hào)由實(shí)時(shí)信號(hào)處理器（RP2.1,Tucker Davis Technologies,TDT,USA)產(chǎn)生，經(jīng)衰減器(PA5 TDT,USA)和放大器(Crown XLS 202,Harman Inter?national Company,USA)傳至揚(yáng)聲器(NSD2005-8,Eminence,USA)。噪聲暴露在隔聲室內(nèi)進(jìn)行，揚(yáng)聲器懸掛于動(dòng)物籠子正上方30cm處。應(yīng)用聲級(jí)計(jì)(LD-PCB,model 800B,APCB Piezotronics Div.,Lar?son Davis,USA)、前置放大器(LD-PCB,model 825,Larson Davis,USA)和電容式微音器(Larson and Da?vis,LDL 2559,USA)測(cè)量校準(zhǔn)噪聲強(qiáng)度。噪聲暴露條件為:寬帶1-7kHz，120dBSPL，1小時(shí)。

1.5 損傷的感覺(jué)細(xì)胞評(píng)估

噪聲暴露后10天，ABR測(cè)試，CO2深度麻醉動(dòng)物后處死，快速解剖取出雙側(cè)耳蝸,10%福爾馬林室溫固定4小時(shí)，為減少解剖因素造成人為的組織損傷，采用本課題組建立的原位耳蝸基底膜毛細(xì)胞觀察方法[7]，染色評(píng)估噪聲暴露后耳蝸毛細(xì)胞損傷情況。顯微鏡下去除蝸尖和外側(cè)壁部分，充分暴露耳蝸基底膜。用Alexa Fluor 488 phalloidin（1：75，Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA,10mM PBS稀釋)染色耳蝸毛細(xì)胞絲狀肌動(dòng)蛋白（Filamentous actin,F-actin）。室溫避光孵育30分鐘，PBS液漂洗后將耳蝸置于培養(yǎng)皿中，熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 CD45熒光免疫抗體標(biāo)記耳蝸基底膜

噪聲暴露后1、4、10天快速解剖取出雙側(cè)耳蝸,經(jīng)10%福爾馬林4°C過(guò)夜固定后，分離耳蝸基底膜，將分離的耳蝸基底膜置入10mM PBS液清洗后，移入0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，10%羊血清白蛋白，10mM PBS液稀釋?zhuān)琾H 7.40）液中，室溫作用1h。10mM PBS液清洗組織后，將耳蝸基膜移入10mM PBS稀釋的CD45抗體(goat CD 45 polyclonal antibody 1:200,AF114,RD Inc.,USA)液中4°C過(guò)夜。PBS液清洗組織后，將耳蝸基膜移入10 mM PBS稀釋的二抗液中(Alexa Fluor?488 donkey anti-goat IgG,1:200 in PBS,Invitrogen)室溫孵育2h，PBS液清洗組織。為鑒別非特異性染色，小塊標(biāo)本僅用二抗液孵育。將標(biāo)本移入5μg/ml碘化丙錠(propidium lodide,PI，Molecular probe,Inc.,Eugene,OR,USA)染色液中(10mM PBS配制)，室溫避光染色10min。將PBS清洗后的標(biāo)本平鋪于載玻片，抗熒光退變劑(ProlongTM Antifade kit,Molecu?lar Probes Inc.USA)封片。

1.7 熒光顯微鏡觀察和計(jì)算機(jī)圖像分析

熒光顯微鏡下(Leica Z6 APO Manual Macro?Fluo,USA)觀察，采用顯微鏡附件數(shù)碼相機(jī)(SPOT RT,Color Diagnostic Instruments,Inc.,Sterling Heights,MI,USA)拍照全耳蝸基底膜，利用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件(Adobe Photoshop CS6,version 13.0.1,Adobe Systems,San Jose,CA,USA)自動(dòng)合成視圖。觀察噪聲暴露后小鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞和免疫細(xì)胞形態(tài)變化，自耳蝸?lái)敾氐降谆赜?jì)數(shù)全耳蝸基底膜缺失的毛細(xì)胞和CD45熒光染色陽(yáng)性的免疫細(xì)胞。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SigmaStat(Version3.5,San Jose,CA,USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。比較噪聲暴露前與噪聲暴露后10天小鼠不同頻率ABR閾值(x±s)，采用兩因素方差分析檢驗(yàn)（時(shí)間×頻率）。比較噪聲暴露前與噪聲暴露后10天小鼠耳蝸基底膜頂回、底回毛細(xì)胞缺失數(shù)目(x±s)，采用兩因素方差分析檢驗(yàn)（時(shí)間×部位）。比較噪聲暴露前與噪聲暴露后1、4、10天小鼠耳蝸基底膜頂回、底回CD45免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目±s)，采用兩因素方差分析檢驗(yàn)（時(shí)間×部位）。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 噪聲暴露后小鼠聽(tīng)閾升高

噪聲暴露前和噪聲暴露后10天，分別進(jìn)行ABR檢測(cè)，了解噪聲暴露對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)功能的影響，結(jié)果顯示噪聲暴露后所有檢測(cè)頻率的ABR閾值均明顯提高(F=1622.754,df=1,104,P＜0.001;Tukey test,P＜0.001)，4個(gè)頻率的平均閾值由37.3±15.1 dBSPL提高至75.3±11.1 dBSPL，平均閾移為38.0±9.0 dBSPL，見(jiàn)圖1B所示。

2.2 噪聲致耳蝸毛細(xì)胞損傷

Alexa 488-labeled phalloidin染色毛細(xì)胞纖毛、表皮板后，熒光顯微鏡下觀察噪聲爆震后10天耳蝸基膜毛細(xì)胞形態(tài)的變化，如圖1A所顯示,外毛細(xì)胞損傷明顯,外毛細(xì)胞染色區(qū)缺失被記為毛細(xì)胞缺失。缺失的細(xì)胞出現(xiàn)在三排外毛細(xì)胞，第3排外毛細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，其次為第2排、第1排外毛細(xì)胞。定量觀察發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后全耳蝸基底膜毛細(xì)胞缺失數(shù)目增多，底回外毛細(xì)胞缺失數(shù)目明顯多于頂回(F=92.484,df=1,40,P＜0.001;Tukey test,P＜ 0.001)，見(jiàn)圖1C所示。

2.3 免疫細(xì)胞在耳蝸基底膜底面的分布和形態(tài)特點(diǎn)

熒光顯微鏡下觀察，在生理?xiàng)l件下小鼠耳蝸基底膜底面（鼓階面）存在CD45陽(yáng)性免疫細(xì)胞，這些陽(yáng)性免疫細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞分布于全耳蝸外側(cè)壁和骨螺旋板之間的耳蝸基底膜。CD45陽(yáng)性細(xì)胞存在多種形態(tài)，其不同形態(tài)與耳蝸存在的部位相關(guān)。小鼠耳蝸基底膜為兩圈，頂回的巨噬細(xì)胞胞體呈樹(shù)枝狀，多個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，胞漿少，細(xì)胞核多，核呈不規(guī)則型（見(jiàn)圖2A，細(xì)胞核染色未出示)。底回細(xì)胞胞體呈樹(shù)干狀或不規(guī)則的圓形、卵圓形，枝狀突起縮短、減少或消失，胞漿增多（見(jiàn)圖2D)。除巨噬細(xì)胞外，極少量的單核細(xì)胞存在于耳蝸基底膜底面，單核細(xì)胞為小圓型，細(xì)胞核大而圓。

2.4 噪聲暴露后耳蝸基底膜免疫細(xì)胞的變化

圖1 噪聲暴露后10天耳蝸聽(tīng)功能下降毛細(xì)胞損傷。A:Alexa 488-labeled phalloidin染色的小鼠耳蝸基底膜底回毛細(xì)胞(200×)，噪聲暴露后第3排外毛細(xì)胞缺失數(shù)目最多，箭頭示缺失的外毛細(xì)胞區(qū)域，標(biāo)尺=100m;B：比較噪聲暴露前后小鼠4個(gè)頻率ABR閾值的變化，噪聲暴露后10天小鼠不同頻率ABR閾值均明顯高于對(duì)照組(P＜0.001);C:定量觀察噪聲暴露后10天耳蝸基底膜頂回、底回外毛細(xì)胞缺失數(shù)目。與對(duì)照組比較，噪聲暴露后小鼠耳蝸基底膜頂回、底回外毛細(xì)胞缺失數(shù)目均增多，實(shí)驗(yàn)組底回外毛細(xì)胞缺失數(shù)目明顯多于頂回(P＜0.001)。Fig.1 Structural damage and functional loss of the cochleae examined at10 days after exposure to an intense noise at120 dB sound pressure level(SPL)for 1 hour.A:Typical image of F-actin staining using Alexa 488-labeled phalloidin in hair cells in the basal section of cochlea(200×).The third row of out hair cells(OHCs)show the most damage,followed by the second and first rows of OHCs．Arrows point to the areas of missing outer hair cells.Bar=100m.B:Comparison of ABR thresholds at the 4 tested frequencies before and after noise exposure groups.The thresholds are significantly elevated above baseline with an increase at all tested frequencies in animal after noise exposure P＜0.001.C:Comparison of the number of missing OHCs before and afternoise exposure in the apical and basal sections in the basilarmembrane of cochlea.The average number of missing cells in the noise-injured ears is significantly higher than in the control ears P ＜0.001，and the average number of missing cells in the basal section is significantly higher than that observed in the apical section P＜0.001.

噪聲暴露后1天，單核細(xì)胞滲入耳蝸基底膜鼓階面，侵潤(rùn)的CD45陽(yáng)性的小圓細(xì)胞出現(xiàn)在耳蝸基底膜與外側(cè)壁交界處(見(jiàn)圖2E)，主要分布于耳蝸基底膜底回的上部,其分布與耳蝸感覺(jué)細(xì)胞損傷主要區(qū)域相吻合。噪聲暴露后4天，CD45陽(yáng)性的小圓細(xì)胞胞體變大，出現(xiàn)細(xì)而短的突起，表明單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞(見(jiàn)圖2C,F)。盡管耳蝸基底膜原有巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，但由于大量單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，耳蝸基底膜底回CD45陽(yáng)性細(xì)胞密度增加(見(jiàn)圖2F)。噪聲暴露后10天，耳蝸基底膜CD45陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無(wú)明顯改變。噪聲暴露后Corti氏器未見(jiàn)單核細(xì)胞遷入。圖3顯示噪聲暴露前及噪聲暴露后1,4,10天耳蝸基底膜頂回、底回CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。噪聲暴露后1天，耳蝸基底膜CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組略有增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。噪聲暴露后4天，耳蝸基底膜頂回、底回CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均較正常對(duì)照組明顯增加(F=15.205,df=3,46,P＜0.001;Tukey test,P＜0.001)，耳蝸底回CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目多于頂回P＜0.05。噪聲暴露后10天，CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目下降接近對(duì)照組。

圖2 噪聲暴露前后耳蝸基底膜底面CD45標(biāo)記的免疫細(xì)胞形態(tài)。A,B,C:耳蝸基底膜頂回。D,E,F：耳蝸基底膜底回。A和D,B和E,C和F分別為正常對(duì)照，噪聲暴露后1天，4天耳蝸基底膜免疫細(xì)胞。箭頭示不同時(shí)間典型的免疫細(xì)胞形態(tài)，標(biāo)尺=40m.Fig.2 Typical morphology of immune cells stained w ith CD45 beneath the basil armembrane of cochlea before and after noise exposure.A,B and C:Morphology of immune cells in the apical section.D,E and F:Morphology of immune cells in the basal section.A and D,B and E,Cand F:Morphology of immune cells before and 1day,4 days after noise exposure respectively.Arrowspoint to the typical morphology of immune cells in the different time.Bar=40m.

圖3 噪聲暴露前及噪聲暴露后1天、4天和10天耳蝸基底膜底面頂回、底回CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。與噪聲暴露前比較，噪聲暴露后4天耳蝸基底膜頂回、底回CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組P＜0.001，底回CD45陽(yáng)性數(shù)目明顯多于頂回 P＜0.05。Fig.3 Comparison of the numbers of CD45 positive cells in the apical and basal sections in the basilarmembrane of cochlea between the control and after noise exposure 1,4 and 10 days groups.The number of immune cells in the apical and basal sections at 4 days post-noise exposure is significantly greater than in the control group P ＜ 0.001，and the average number of CD45 positive cells in the basal section is significantly higher than that observed in the apical section P＜0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)小鼠ABR檢測(cè)和缺失毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，噪聲暴露后動(dòng)物存在耳蝸聽(tīng)功能和感覺(jué)細(xì)胞的損傷。我們研究的主要目的是揭示耳蝸基底膜鼓階面免疫細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及噪聲暴露后的變化。其主要發(fā)現(xiàn)：1，正常動(dòng)物耳蝸基底膜底側(cè)面存在巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞呈現(xiàn)不同的形態(tài)特點(diǎn)。2，噪聲暴露后出現(xiàn)時(shí)間相關(guān)的單核細(xì)胞滲入和轉(zhuǎn)化。3，噪聲暴露后單核細(xì)胞滲入與感覺(jué)細(xì)胞損傷區(qū)域相吻合。4，噪聲暴露后耳蝸基底膜底回毛細(xì)胞缺失與免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多的趨勢(shì)相一致。表明單核細(xì)胞侵潤(rùn)是噪聲暴露后耳蝸基底膜的主要免疫反應(yīng)。

CD45是白細(xì)胞共同抗原，巨噬細(xì)胞常用的標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)采用CD45免疫熒光標(biāo)記耳蝸基底膜免疫細(xì)胞。Hirose K等在2017年報(bào)道中指出，耳蝸內(nèi)的巨噬細(xì)胞不是小膠質(zhì)細(xì)胞[8]。主要依據(jù)：1，細(xì)胞表面標(biāo)記物和功能蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞表達(dá)CD68，CD45，iba-1,F4/80和CX3CR1，證明這些細(xì)胞具有典型的組織巨噬細(xì)胞的性質(zhì)。2，內(nèi)耳的巨噬細(xì)胞體積大，突起粗，分布于內(nèi)耳組織。與巨噬細(xì)胞相比，小膠質(zhì)細(xì)胞體積小，突起細(xì)，分布于腦實(shí)質(zhì)組織內(nèi)。3，定居型耳蝸組織巨噬細(xì)胞存在更新，組織巨噬細(xì)胞源自血液中的單核細(xì)胞，單核細(xì)胞源自骨髓中的前體細(xì)胞。而小膠質(zhì)細(xì)胞則源于卵黃囊中胚層的原始細(xì)胞。γ射線照射殺死耳蝸內(nèi)巨噬細(xì)胞和所有骨髓造血細(xì)胞的小鼠，接受健康動(dòng)物帶有內(nèi)源性熒光標(biāo)記的骨髓移植后的2-3月內(nèi)，重新構(gòu)建了耳蝸內(nèi)的組織巨噬細(xì)胞。證明定居型耳蝸組織巨噬細(xì)胞源自骨髓中的前體細(xì)胞，而小膠質(zhì)細(xì)胞不能更新定居型耳蝸組織的巨噬細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)觀察到噪聲暴露后，單核細(xì)胞滲入耳蝸基底膜，并轉(zhuǎn)化為組織巨噬細(xì)胞的結(jié)果,支持耳蝸基底膜的組織巨噬細(xì)胞不是小膠質(zhì)細(xì)胞的觀點(diǎn)。

在生理情況下，耳蝸的螺旋韌帶、螺旋板、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋周?chē)艽嬖诿庖呒?xì)胞[9-12]。本文報(bào)道了耳蝸基底膜的底部存在巨噬細(xì)胞的分布特點(diǎn)，這些細(xì)胞從頂回到底回分布于整個(gè)耳蝸基底膜，廣泛的分布模式表明全耳蝸基底膜存在免疫監(jiān)督。耳蝸基底膜組織巨噬細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)為本研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，值得注意的是，生理?xiàng)l件下巨噬細(xì)胞的形態(tài)與其在耳蝸基底膜部位相關(guān)。頂回的巨噬細(xì)胞呈樹(shù)枝狀，而底回的巨噬細(xì)胞呈不規(guī)則狀,推論基底膜巨噬細(xì)胞存在多種亞群體。這種異質(zhì)性表明，耳蝸基底膜頂回和底回的巨噬細(xì)胞具有部位相關(guān)的不同功能，其在耳蝸基底膜頂回和底回的功能尚不清楚。研究表明，耳蝸基底膜底回的感覺(jué)細(xì)胞對(duì)老化和噪聲等損傷較頂回更為敏感[13,5]，不同的免疫功能可能是其作用之一。

組織巨噬細(xì)胞分為定居型和游走型。巨噬細(xì)胞源自于單核細(xì)胞，有研究報(bào)道，噪聲暴露后單核細(xì)胞滲入耳蝸組織，其在耳蝸損傷和恢復(fù)中的作用尚不清楚[9,11,14]。我們發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后1天單核細(xì)胞侵潤(rùn)耳蝸基底膜的底面，噪聲暴露后4天轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。前期研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后10分鐘耳蝸基底膜外毛細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，30分鐘可見(jiàn)核腫脹細(xì)胞[15]。噪聲暴露后耳蝸基底膜單核細(xì)胞的滲入和轉(zhuǎn)化發(fā)生在噪聲暴露后1-4天，推論耳蝸細(xì)胞的免疫反應(yīng)發(fā)生在耳蝸基底膜細(xì)胞損傷之后，時(shí)間相關(guān)的單核細(xì)胞滲入及巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)換是耳蝸免疫反應(yīng)一個(gè)重要的起始步驟。噪聲暴露后10天耳蝸基底膜免疫細(xì)胞數(shù)目接近噪聲暴露前水平，與噪聲暴露后內(nèi)耳免疫炎性反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道結(jié)果相吻合[14]。

單核細(xì)胞從何處進(jìn)入耳蝸基底膜并不十分清楚，有學(xué)者認(rèn)為單核細(xì)胞從骨螺旋板血管和它的分支進(jìn)入耳蝸基底膜[16]。我們認(rèn)為耳蝸外側(cè)壁可能是單核細(xì)胞進(jìn)入耳蝸基底膜的主要部位，因?yàn)槎佂鈧?cè)壁的血管紋和螺旋韌帶存在豐富的血管系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞簇存在于耳蝸基底膜與外側(cè)壁的連接處，推論單核細(xì)胞主要來(lái)自耳蝸外側(cè)壁的血管。

單核細(xì)胞的滲入和轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在耳蝸基底膜的底回上部，其與感覺(jué)細(xì)胞損傷主要區(qū)域相吻合。組織的巨噬細(xì)胞具有三種基本的免疫功能：損傷細(xì)胞的吞噬，產(chǎn)生炎性分子，抗原呈遞作用[2,8,17]。巨噬細(xì)胞屬于抗原呈遞細(xì)胞，加工處理抗原，將其傳遞給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。定量研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露后耳蝸底回毛細(xì)胞缺失和CD45陽(yáng)性免疫細(xì)胞數(shù)目增多的結(jié)果相一致,推論巨噬細(xì)胞參與了噪聲性耳蝸基底膜感覺(jué)細(xì)胞的損傷過(guò)程。巨噬細(xì)胞分為兩種亞型，即M1型和M2型。M1型參與促炎反應(yīng)，M2型參與抗炎反應(yīng)[18]。活化的M2型巨噬細(xì)胞能夠分泌大量的抗炎因子如IL-10等,下調(diào)M1型啟動(dòng)的免疫應(yīng)答，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮修復(fù)作用[19-20]。噪聲暴露后耳蝸毛細(xì)胞通過(guò)兩種方式死亡，即凋亡和壞死。凋亡細(xì)胞死亡后被吞噬細(xì)胞清除，不造成炎性反應(yīng)。壞死細(xì)胞死亡后，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜破裂，釋放大量溶酶體內(nèi)的水解酶，造成周?chē)?xì)胞的次級(jí)損傷。組織巨噬細(xì)胞在耳蝸損傷早期階段可能發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，在耳蝸損傷晚期階段參與組織的修復(fù)過(guò)程，其具體功能有待于進(jìn)一步研究揭示。

總之，免疫應(yīng)答是耳蝸對(duì)各種損傷的一種重要反應(yīng)。作為耳蝸免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要參與者，耳蝸基底膜組織巨噬細(xì)胞存在于耳蝸基底膜鼓階側(cè)面。巨噬細(xì)胞是耳蝸基底膜組織主要的免疫細(xì)胞，在生理?xiàng)l件下巨噬細(xì)胞分布于整個(gè)耳蝸基底膜。這些細(xì)胞在耳蝸基底膜的頂回和底回呈現(xiàn)不同的形態(tài)。噪聲暴露后單核細(xì)胞滲入耳蝸基底膜轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)化的時(shí)間、主要部位及細(xì)胞數(shù)量的變化，提示免疫細(xì)胞在噪聲暴露后耳蝸的損傷和修復(fù)中起到重要的作用。

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