鄭藝華

(青島大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院 生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究室，山東 青島 266071)

量熱分析方法[1]通過測量各種熱變化探索和建立內(nèi)部反應(yīng)現(xiàn)象、機(jī)理和規(guī)律，是進(jìn)行反應(yīng)熱動(dòng)力學(xué)研究，以及進(jìn)行分析檢測的主要方法和手段。比較而言，量熱分析方法通用性強(qiáng)，不受光學(xué)及電化學(xué)等屬性的干擾，滿足實(shí)際試樣的要求。

目前，各種類型的商用量熱儀靈敏度和分辨率已達(dá)到微納瓦級別，但價(jià)格昂貴、環(huán)境要求苛刻，主要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行理論分析和熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)研究。而在應(yīng)用方面，以量熱式生物傳感器為代表的量熱分析系統(tǒng)能準(zhǔn)確而快速地進(jìn)行分析測試[2-5]，通過結(jié)合微流控分析和借助微納米加工技術(shù)構(gòu)建微納米系統(tǒng)[6-7]是其重要的創(chuàng)新方向和潛在發(fā)展領(lǐng)域。

熱信號是表觀、宏觀量，量熱方法應(yīng)用在痕量分析的特異性和靈敏度往往不盡如人意。一般地，其特異性可通過參比[8]并結(jié)合特定的生物敏感元件(酶、細(xì)胞等)來實(shí)現(xiàn)，但如果反應(yīng)過程的熱量變化很小，如α-糜蛋白酶催化ATEE水解的反應(yīng)焓變僅為-1.1 kJ/mol，測量將非常困難，簡單通過增大熱傳感器靈敏度[9]并結(jié)合預(yù)測算法[10]來提升靈敏度的方法有限，并不能提高信噪比。采用化學(xué)放大方法是一種有效途徑，但僅從加大濃度等方面來考慮會(huì)增大系統(tǒng)比熱，易造成沉淀，影響反應(yīng)進(jìn)程，通過富集減少樣品量，降低檢出限，進(jìn)一步利用質(zhì)子化反應(yīng)和級聯(lián)反應(yīng)等手段增大反應(yīng)熱焓是最佳方案，靈敏度和選擇性能的提高適用于分析檢測定量化和小樣化的發(fā)展趨勢。

1 富 集

富集是分析預(yù)處理的必要步驟，是排除干擾、降低檢出限、提高分析精度的重要手段，目前離線富集方式需手工操作，繁瑣、耗時(shí)長，同時(shí)增加檢測的復(fù)雜性和不確定性，也增加了誤差傳遞過程。流動(dòng)注射技術(shù)[11]的在線分離富集功能克服了手動(dòng)操作的缺陷，使重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度顯著提高。但仍需利用洗脫液，并且分離、富集和洗脫各步驟獨(dú)立，流程和流路復(fù)雜，易干擾，效果受洗脫液性質(zhì)制約。固相光度法自被Yoshimura等[12]提出以來，已廣泛應(yīng)用于各分析檢測領(lǐng)域[13]，該法集分離、富集、測試于一體，分析檢測直接在固體基質(zhì)表面進(jìn)行，但由于采用可見光、紫外、熒光和光譜測試等光度方法，固相載體的透射或反射等光學(xué)性能限制了自身的選擇范圍及固相光度法的應(yīng)用。

圖1 富集、檢測一體化量熱式生物傳感器系統(tǒng)原理圖[17]Fig.1 Schematic diagram of the calorimetric biosensor with integrated of concentration and detection[17]1.six-way valve;2.sixteen-way valve;3.peristaltic pump;4.thermostat;5.injection valve;6.thermopile;7.reaction cell;8.reference cell;9.data acquisition module

通過相關(guān)基礎(chǔ)微量熱分析研究[14-15]，集成富集的量熱分析方法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品基體分離和目標(biāo)組分富集，提高有效信號強(qiáng)度，并改善其特異性，滿足對微量組分分析檢測的需求。富集、檢測一體化量熱式生物傳感器[16]省略了傳統(tǒng)的洗脫等步驟，實(shí)現(xiàn)了在線分離、富集、反應(yīng)、檢測一體化，方法簡單、快速、樣品消耗量少，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。如圖1所示系統(tǒng)[17]用以測試重金屬污染，反應(yīng)室和參比室內(nèi)填充富集載體，先富集樣液的重金屬，然后通入脲酶進(jìn)行抑制，最后注入底物并在富集載體上發(fā)生酶反應(yīng)，進(jìn)行量熱測定，有無重金屬抑制條件下，脲酶活性發(fā)生變化，反映了重金屬對脲酶反應(yīng)的影響，進(jìn)而得到重金屬濃度，在0.002～0.01 mol/L濃度范圍內(nèi)，抑制率與銅離子的初始濃度接近線性關(guān)系，檢出限為0.001 mol/L。

2 緩沖液放大

“緩沖液放大”是化學(xué)放大方法中最簡單、最常用的方法，即利用緩沖溶液的質(zhì)子化反應(yīng)焓變實(shí)現(xiàn)熱焓放大。假設(shè)存在反應(yīng)(1)，其過程中釋放出n個(gè)質(zhì)子。

X→Y+nH+;ΔHX,Y

(1)

當(dāng)反應(yīng)發(fā)生在緩沖液體系中，釋放的質(zhì)子會(huì)被對應(yīng)的共軛堿捕捉并結(jié)合，同時(shí)伴隨著質(zhì)子焓變。

A-+H+→AH;ΔHr

(2)

那么反應(yīng)過程總的焓變應(yīng)為：

ΔHTotal=ΔHX,Y+ΔHr

(3)

所以，即使反應(yīng)焓變很小，只要反應(yīng)產(chǎn)生的質(zhì)子被緩沖液捕獲，發(fā)生并發(fā)質(zhì)子化反應(yīng)同時(shí)放出熱量，反應(yīng)焓變與質(zhì)子化反應(yīng)焓變共同作用仍會(huì)得到理想的反應(yīng)焓變。如α-糜蛋白酶水解ATEE的反應(yīng)在使用Tris緩沖液后，由于質(zhì)子化放大作用，反應(yīng)過程焓變由-1.1 kJ/mol增加為- 47.5 kJ/mol，熱信號測量將非常容易。然而，質(zhì)子化反應(yīng)也可能帶來問題，高質(zhì)子化焓變緩沖液的使用可能產(chǎn)生相反的效應(yīng)。例如，對于乳酸脫氫酶催化乳酸到丙酮酸，使用Tris緩沖液，測得的反應(yīng)焓為-15.3 kJ/mol，如果使用磷酸鹽緩沖液，測得的反應(yīng)焓為- 47.3 kJ/mol[18]。故進(jìn)行量熱分析時(shí)，不一定選擇高質(zhì)子化焓變緩沖液，而需選擇合適緩沖液種類。

基于反應(yīng)設(shè)計(jì)和分析的需要，眾多學(xué)者對質(zhì)子化反應(yīng)及焓變進(jìn)行研究。在缺乏精密量熱手段的時(shí)代，Bernhard等[19]通過文獻(xiàn)值理論計(jì)算得到了Tris和磷酸鹽緩沖液的質(zhì)子化反應(yīng)常數(shù)和熱焓值；Roig等[20]量熱分析了生物學(xué)研究常用的緩沖液(HEPES、PIPES、HEPPS、BES)，并得到了不同溫度狀態(tài)下各緩沖液的質(zhì)子化反應(yīng)焓變；Jumean團(tuán)隊(duì)[21-25]對生化應(yīng)用混合溶劑環(huán)境下的多種緩沖液(BES、TES、TABS、TAPS、TAPSO、MOPS、MOBS、MOPSO等) 的質(zhì)子化反應(yīng)及焓變進(jìn)行了系列微量熱研究。表1列出了20種常用緩沖液的質(zhì)子化反應(yīng)焓。

表1 不同緩沖液的質(zhì)子化反應(yīng)焓[26]Table 1 The protonation reaction enthalpy of different buffers[26]

圖2 緩沖液體系的影響Fig.2 Influence of the buffer system

不同緩沖液在不同體系和不同催化反應(yīng)過程的質(zhì)子化反應(yīng)和作用機(jī)理[27-31]可以應(yīng)用到各量熱分析領(lǐng)域。如膽堿酯酶抑制法是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，但膽堿酯酶反應(yīng)水解熱較低，故普遍利用了磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液進(jìn)行熱放大。Morgan等[32]使用磷酸鹽緩沖液和固定化丁酰膽堿脂酶，利用酶熱敏電阻實(shí)現(xiàn)了對水中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥的自動(dòng)化連續(xù)監(jiān)測，得到了不同農(nóng)藥種類與濃度和酶半衰期的時(shí)間關(guān)系；Mattiasson等[33]使用分流式酶熱敏電阻，利用Tris緩沖液的質(zhì)子化放大作用，分別采用農(nóng)藥水解酶和酶抑制方法對不同種類的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了測定，檢出限分別達(dá)10 mg/L和 1 mg/L；此外，脲酶抑制方法檢測重金屬具有優(yōu)勢，脲酶反應(yīng)本身有理想的水解熱值，通過緩沖液放大后可以達(dá)到60 kJ/mol[34]。如表2所示，不同緩沖液和pH值對脲酶水解反應(yīng)焓變存在直接的影響，借助反應(yīng)熱變化得到的酶反應(yīng)初速度來表示脲酶的活性，選擇合適的緩沖液可以定量分析重金屬離子 Cd2+、As3+、Zn2+，并可通過不同靈敏度實(shí)現(xiàn)特定重金屬離子的鑒別[38-39]，結(jié)果如圖2所示。文獻(xiàn)[40]也利用緩沖液放大研究了重金屬離子的抑制作用，圖3給出了citrate、acetate、tris-maleate 3種緩沖液下脲酶對重金屬離子Cu2+、Hg2+抑制率的變化。由此可見，緩沖液熱放大的研究結(jié)果對利用量熱方法進(jìn)行農(nóng)藥、重金屬污染定量和半定量的快速分析具有較大的實(shí)用價(jià)值。

SolventCp(J·mL-1·K-1)RelativesensitivityAceticacid2 161 93Acetone1 702 46Benzene1 532 73Carbondisulphide1 622 58Carbontetrachloride1 363 07Chloroform1 442 901，4?Dichlorobenzene1 213 46Diethylether1 652 53Ethanol1 962 13Ethylacetate1 742 40n?Hexane1 492 80Methanol2 022 07Toluene1 562 68Water4 181 00

3 非水溶液體系

非水媒介反應(yīng)在生物、化學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用加強(qiáng)并擴(kuò)展了對非水媒介反應(yīng)特性的深入研究，目前量熱分析[41-42]研究涉及各種有機(jī)溶劑組成的非水溶液體系(表3)，并應(yīng)用于膽固醇、過氧化物、甘油三脂和青霉素等的分析測量研究[43-47]。研究表明，由于較低的熱容(數(shù)據(jù)見表3)，非水溶液體系的量熱靈敏度高于水溶液體系，緩沖液水溶液中存在適量的有機(jī)溶劑能使量熱信號倍增。根據(jù)量熱分析，通過溶劑氫鍵網(wǎng)格的影響，水的存在狀態(tài)會(huì)極大地影響非水溶液體系以及緩沖液質(zhì)子化反應(yīng)的焓變[48-49]。

4 級聯(lián)反應(yīng)放大

級聯(lián)反應(yīng)放大是化學(xué)放大中最直接有效的方法，能提高有效信號強(qiáng)度，增大信噪比，降低檢出限。早在1853年，F(xiàn)riedrich Mohr利用氯水氧化放大碘化物，能得到6倍的最初的量，后人采用次氯酸鹽、溴水等氧化劑替代氯水深入研究了這種直接化學(xué)放大方法[50]。目前已出現(xiàn)組合酶放大[51]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[52](PCR) 等技術(shù)，并廣泛應(yīng)用在檢測、分析等領(lǐng)域。

利用酶的組合，可通過連續(xù)的酶反應(yīng)來提高反應(yīng)焓變，先前的產(chǎn)物可被連續(xù)地催化，最終得到的是焓變總和。如使用葡萄糖氧化酶(GOD)來測定葡萄糖[53-54]，存在以下反應(yīng)：

(4)

如果同時(shí)包含過氧化氫酶(Catalase,CAT)，那么：

(5)

過氧化氫酶水解過氧化氫的熱焓約為87 kJ/mol，反應(yīng)總焓變有效提升，同時(shí)被葡萄糖消耗的氧可通過H2O2的分解部分再生，降低了H2O2的危害，并可增加線性范圍。底物濃度較低時(shí)，尤其有效。級聯(lián)反應(yīng)(4)～(5)也用于纖維二糖水解酶水解纖維二糖的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)熱分析研究中，因纖維二糖水解酶水解纖維二糖的產(chǎn)物為葡萄糖，繼續(xù)應(yīng)用反應(yīng)式(4)～(5)，進(jìn)行反應(yīng)熱焓放大，能夠?qū)⑵渲祻?.5 kJ/mol放大到360 kJ/mol，解決單獨(dú)纖維二糖水解酶水解反應(yīng)熱量小，難以進(jìn)行熱分析研究的問題[55]。

圖4 乳酸氧化酶、乳酸脫氫酶和過氧化氫酶的放大系統(tǒng)[56]Fig.4 Amplification system composed by LDH,LOD and CAT[56]

另一種級聯(lián)反應(yīng)放大的方式是底物或副酶循環(huán)再生使用，通過預(yù)置副酶柱或同時(shí)固定多種酶來實(shí)現(xiàn)，可以提高靈敏度上千倍。Scheller等[56]采用此方法測定丙酮酸和乳酸，檢出限達(dá)10 nmol/L，焓變高達(dá)-225 kJ/mol。它同時(shí)利用了乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)、乳酸氧化酶(Lactate oxidase,LOD)和過氧化氫酶，存在連鎖反應(yīng)(圖4)。反應(yīng)中乳酸被乳酸氧化酶氧化為丙酮酸(Pyruvate)，然后丙酮酸被乳酸脫氫酶脫氫為乳酸(L-Lactate)，周而復(fù)始，形成循環(huán)放大。同時(shí)，存在連續(xù)的過氧化氫酶的氧化反應(yīng)，也放大了反應(yīng)焓變。

農(nóng)藥殘留和重金屬污染等在環(huán)境中的存在濃度低，且狀態(tài)和形式多樣，若在現(xiàn)場對實(shí)際試樣進(jìn)行快速靈敏檢測，除利用緩沖液對膽堿酯酶水解反應(yīng)進(jìn)行熱放大外，采用酶級聯(lián)反應(yīng)也是有效手段。Bhand等[57]對熱敏電阻裝置進(jìn)行了改進(jìn)，增加了預(yù)置酶柱，其中放置乙酰膽堿酯酶(Acetylcholin esterase，AChE)，AChE被農(nóng)藥抑制，產(chǎn)物膽堿的量減少并與被抑制的程度成正比，進(jìn)一步地，膽堿的量可通過膽堿氧化酶(Choline oxidase，CHOD)和過氧化氫酶的級聯(lián)反應(yīng)熱量得到，該檢測利用了乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶和過氧化氫酶的級聯(lián)反應(yīng)，其靈敏度較高，檢測限為20～150 μg/L，其原理為反應(yīng)式(6)～(8)。

(6)

(7)

(8)

Xu等[58]提供了相對廉價(jià)的農(nóng)藥殘留量熱分析解決方案，利用動(dòng)植物體提取的替代酯酶和酚氧化酶完成級聯(lián)酶反應(yīng)，并通過離子交換法固定在樹脂上，進(jìn)行檢測時(shí)，替代酯酶被農(nóng)藥抑制，然后利用酚氧化酶催化替代酯酶反應(yīng)的產(chǎn)物酚類物質(zhì)，反應(yīng)熱量變化增大了33倍，增強(qiáng)了熱分析的靈敏度和性能。

Zheng等[59]將化學(xué)熱放大原理應(yīng)用于重金屬檢測，使用由醇氧化酶(Alcohol oxidase)和過氧化氫酶組成的固定化酶實(shí)現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng)，醇氧化酶被重金屬汞競爭性抑制，過氧化氫酶能催化醇氧化酶的水解產(chǎn)物——過氧化氫，通過級聯(lián)反應(yīng)，提升反應(yīng)總熱焓，大大提高檢測靈敏度和分辨率。

5 總結(jié)與展望

化學(xué)放大方法和技術(shù)是突破量熱分析方法選擇性和靈敏度限制，提升其性能的根本有效手段和途徑。量熱分析方法可通過富集、緩沖液放大、非水溶液體系、級聯(lián)反應(yīng)等化學(xué)放大方法和手段從根本上提高量熱分析的選擇性、靈敏度和分析性能。上述熱放大手段的使用可使一些測試的檢測限從ppm級達(dá)到ppb級。

結(jié)合化學(xué)放大的量熱分析方法能提供兼顧速度、靈敏度和準(zhǔn)確性分析檢測的有效方案和途徑，尤其適合現(xiàn)場和快速痕量分析檢測應(yīng)用，以量熱式生物傳感器為代表的量熱分析系統(tǒng)已應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、重金屬污染和安全分析監(jiān)測等領(lǐng)域，借助于化學(xué)放大技術(shù)，量熱分析方法將具備更廣闊的應(yīng)用前景。

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