李 瑋，耿健強，涂光忠

(1.北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100094；2.北京微量化學研究所，北京 100091)

近年來，隨著國內消費者對保健食品需求的不斷上升，保健食品中非法添加化學成分事件也日益突顯[1-3]。非法添加現(xiàn)象導致公眾對保健食品的信任度大幅降低，已成為社會關注的熱點。保健食品中非法添加的化學藥品成分存在劑量不明確、種類不清晰、物質相互作用不確切等風險[4]，對消費者健康危害很大[5-6]，需嚴厲打擊。目前針對保健食品中非法添加化學藥品成分分析的主要方法有薄層色譜法[7-8]、高效液相色譜法[9]、高效液相色譜-質譜法[10]和氣相色譜-質譜法[11]等。上述檢測方法大都是根據(jù)少數(shù)在監(jiān)管范圍內的添加藥物建立的針對目標成分的分析方法[12]，然而隨著添加手段的不斷升級，不法生產者在保健食品中開始添加現(xiàn)行標準檢測范圍之外的其他類物質，以達到規(guī)避監(jiān)管部門檢查的目的。因此，為保障食品安全，需建立針對保健食品中非目標物的準確快速的定性、定量分析方法。

核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)是有機物結構分析的強有力工具，隨著多種新脈沖序列的涌現(xiàn)和多維譜的出現(xiàn)，NMR的功能不斷增強，在復雜混合物的定性、定量分析中發(fā)揮了巨大作用[13-14]。二維擴散排序譜(Diffusion-ordered NMR spectroscopy，2D-DOSY)是依據(jù)分子擴散系數(shù)的差異對來自不同分析物的共振信號進行排序的二維NMR實驗，可以省略分離純化步驟直接研究混合物中各組分的組成，被稱為“NMR中的色譜技術”[15]。NMR脈沖寬度定量(Pulse length based concentration determination，PULCON)技術是以NMR信號強度互易原理[16-17]為基礎的NMR定量實驗，可實現(xiàn)對樣品無需內標的NMR絕對定量。本研究采用2D-DOSY及PULCON等多種NMR技術，對具有減肥功效的保健食品膠囊內容物進行測定分析，鑒出鄰苯二甲酸乙酯、褪黑素、奧美拉唑3種主要成分。在此基礎上，采用PULCON定量方法[18]，測定了膠囊內容物中3種物質的絕對含量，并與HPLC法測定結果進行了對比。結果顯示，本方法具有前處理過程簡單，取樣量小，專屬性強，無需對照品作參比，無需添加內標物質等優(yōu)點，為保健食品中非目標性添加物的快速檢測提供了一種新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

BrukerAVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振譜儀(Bruker公司，美國)，1H載波頻率為600.13 MHz，配有超低溫探頭及Topspin 3.2操作軟件。XS204電子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)。

氘代試劑：重水(D2O，氘代度： 99.8%)、氘代丙酮[(CD3)2CO，acetone-d6氘代度：99.8%]均為美國CIL公司產品。順丁烯二酸(純度≥99%)、鄰苯二甲酸二乙酯(純度≥99%)、褪黑素(純度≥98%)均購于美國Sigma公司；奧美拉唑(純度≥98%)購于百靈威公司；Norell 5 mm核磁管購于美國Norell公司。測試樣品為標稱具有減肥功能的保健品(膠囊)。

1.2 實驗條件

1.2.1定性實驗2D-DOSY實驗調用Bruker儀器脈沖程序ledbpgp2s，檢測溫度300 K，設定參數(shù)D20=20 ms，P30=1 100 μs，掃描次數(shù)NS=16，空掃次數(shù)DS=4，梯度脈沖強度從2%分32 次步進到95%。1H NMR、13C NMR、J-分辨、1H-1H COSY、HSQC、HMBC使用Bruker標準脈沖程序，檢測溫度均為300 K，掃描次數(shù)分別為32、128、8、8、8、32次。

1.2.2定量實驗使用Bruker標儀器脈沖序列zg，檢測溫度300 K，外標脈沖延遲時間D1=20 s，樣品D1=15 s，掃描次數(shù)NS均為64，譜寬SWH為9 014.42 Hz。

1.3 溶液配制

1.3.1樣品溶液制備取待測膠囊內含物，經(jīng)研磨后精確稱取100 mg粉末于離心管中。加氘代丙酮1 mL，渦旋1 min后超聲20 min，10 000 g/min離心10 min，取上清液540 μL于核磁管中，待測。

1.3.2定量外標溶液的配制外標溶液制備：精確稱取適量順丁烯二酸，用D2O配制成2 mmol/L的外標溶液，移取540 μL于核磁管中作為外標定量管，待測。

1.4 樣品測定

1.4.1NMR定性檢測按照Bruker儀器各項標準試驗操作進行。

1.4.2NMR定量檢測采用PULCON法，首先測定外標的1H NMR譜，完成后設置D1=15 s，剩余參數(shù)不變，測定待測樣品的1H NMR圖譜。測定外標及樣品前均需調諧和匹配探頭、精細勻場、測定對應的90°脈沖寬度。測得的定量圖譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理，變換點數(shù)為96 K，用指數(shù)窗函數(shù)處理，基線和相位校正均采用手動方式進行，用公式(1)進行定量計算[18-19]。

(1)

其中c為物質的濃度；S為定量峰的積分面積；n為定量峰所包含的質子數(shù)；θ90為90°脈沖寬度；T為實驗溫度；下標U及R分別代表被測物和外標物；fT為修正因子，當定量外標物和被測物使用同一脈沖在短時間內先后測定時，fT可視為等于1。

1.4.3HPLC法定量檢測稱取50 mg膠囊內含物研磨粉末于具塞錐形瓶中，加入10 mL甲醇，稱重后超聲20 min，放冷，用甲醇補足減少的重量，搖勻，過濾，取濾液1 mL于進樣瓶中，待測。采用HPLC法測定樣品中3種化合物的含量，色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，梯度程序為：0～10 min，27%A；10～15 min，27%～80%A；15～20 min，80%A。進樣量：20 μL，流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。檢測波長：鄰苯二甲酸乙酯228 nm，褪黑素278 nm，奧美拉唑302 nm。

2 結果與討論

2.1 1H NMR圖譜分析

測定供試品溶液的1H NMR譜，結果見圖1。結果顯示，供試品中所含主要成分的共振譜線信號主要集中在1H NMR譜脂肪區(qū)和芳香區(qū)，且各信號的積分強度不同，表明供試品為混合物樣品。為對主要成分進行更可靠的鑒別,獲取了同一樣品的 2D-DOSY核磁共振譜圖。

圖1 供試品溶液的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectrum of the tested solution

圖2 供試品溶液的2D-DOSY譜圖Fig.2 2D-DOSY spectrum of the tested solution

圖3 供試品溶液的2D-DOSY剖面圖Fig.3 2D-DOSY profile of the tested solution

2.2 2D-DOSY圖譜分析

2D-DOSY是利用不同分子擴散系數(shù)差異將混合物樣品的共振譜線在信號維度進行“虛擬分離”的一種NMR技術，能為混合物樣品中物質的鑒定提供重要信息。在 2D-DOSY 譜圖中，橫軸為化學位移，縱軸為擴散系數(shù)?；旌衔锔鹘M分的信號峰因擴散系數(shù)的不同而分布在不同的行中；同一分子物質的信號峰的擴散系數(shù)大致相同，基本在同一水平線上，即達到了虛擬分離的效果。圖2為待測保健品氘代丙酮提取物的2D-DOSY 譜圖。通過對芳香區(qū)2D-DOSY較強信號進行分析，可以判斷樣品中至少含有3個主要化學組分，分別定義為化合物A、B和C。2D-DOSY剖面圖(圖3)可更為清晰地顯示化合物A、 B、 C各自的1H NMR圖譜信息。2D-DOSY圖顯示脂肪區(qū)信號的分離效果較差，因此剖面圖中的脂肪區(qū)域會混入其他物質的信號峰，所以在結構解析時，需參照COSY、HSQC和HMBC等實驗結果進行信號確認。

2.3 樣品中化合物結構解析

根據(jù)2D-DOSY及1H NMR圖譜提示，化合物A中含有δ7.74(m)、δ7.64(m)、δ4.32(q,7.14 Hz)、δ1.33(t,7.14 Hz) 4組質子信號，其中芳香區(qū)的δ7.74和δ7.64兩組信號峰左右對稱且峰形復雜，推測結構中存在相同基團鄰位取代苯環(huán)形成的AA′BB′系統(tǒng)，因此考慮結構中存在鄰位取代苯環(huán)結構。結合多種2D-NMR實驗結果，最終確定化合物A為鄰苯二甲酸二乙酯，結構式見圖4A，具體1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)信號歸屬及二維相關信號見表1。

圖4 A、B、C化合物的結構式Fig.4 Molecular structures of A,B and C

PositionδH(J/Hz)δC1H-13CHSQC1H-1HCOSY1H-13CHMBC1，47 74(m)131 9+H-2，3-2，37 64(m)129 6+H-1，4-5，64 32(q，7 14)62 1+H-7，8-7，81 33(t，7 14)14 4+H-5，6-9，10-168 1--H-1，4，5，611，12-133 5--H-1，4

“+”is correlation;“-”is uncorrelation;the same below(“+”表示有相關信號；“-”表示無相關信號；下同)

根據(jù)2D-DOSY、1H NMR及J-分辨圖譜提示，初步判斷化合物B中含有δ7.25(d,8.76 Hz)、δ7.11(d,2.46 Hz)、δ7.11(s)、δ6.75(dd,2.46,8.76 Hz)、δ3.81(s)、δ3.46(dd,7.14,15.20 Hz)、δ1.85(s) 7組質子信號。進一步結合COSY數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)δ2.87(dd,7.14,15.20 Hz)處的質子信號也屬于化合物B。1H NMR中的耦合信息提示化合物B中存在三取代的苯環(huán)結構，結合多種2D-NMR實驗結果，最終確定化合物B為褪黑素，結構式見圖4B，具體1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)信號歸屬及二維相關信號見表2。

(續(xù)表2)

PositionδH(J/Hz)δC1H-13CHSQC1H-1HCOSY1H-13CHMBC103 46(dd，7 14，15 21)40 6+H-9H-911-169 6--H-10，12121 85(s)27 9+--133 81(s)55 8+--

2D-DOSY、1H NMR及J-分辨圖譜提示化合物C中含有δ8.18(s)、δ7.57(d,8.88 Hz)、δ7.18(d,2.34 Hz)、δ6.96(dd,2.34,8.88 Hz)、δ4.68(s)、δ3.86(s)、δ3.75(s)和δ2.24(s) 8組質子信號。HSQC數(shù)據(jù)顯示，δ2.24(s)處質子信號與兩個碳原子信號相連，結合1H NMR質子積分數(shù)據(jù)，判斷δ2.24(s)為兩組甲基信號。1H NMR中的耦合信息提示化合物C中存在三取代的苯環(huán)結構，進一步結合多種2D-NMR實驗結果，最終確定化合物C為奧美拉唑，結構式見圖4C，具體1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)信號歸屬及二維相關信號見表3。

表3 化合物C的1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)及二維相關信號(acetone-d6)Table 3 1H NMR，13C NMR data and 2D NMR correlations of compound C(acetone-d6)

2.4 PULCON定量方法建立

2.4.1定量特征峰的確定1H NMR圖譜顯示，鄰苯二甲酸二乙酯、褪黑素和奧美拉唑的質子信號在芳香區(qū)無重疊，掃描64次信噪比均大于100，因此分別選定δ7.74，δ7.25和δ8.18三個質子信號作為化合物鄰苯二甲酸二乙酯、褪黑素和奧美拉唑的定量特征峰。

PULCON法定量使用的是外標校正，因此定量外標物的選擇不考慮其溶解性、信號重疊、弛豫時間等因素。由于順丁烯二酸結構簡單，僅在δH6.34(D2O)處有一尖銳單峰，易于辨認，故選定順丁烯二酸為定量外標物。

2.4.2脈沖延遲時間及掃描次數(shù)的確定為避免樣品信號飽和，定量實驗的脈沖延遲時間D1較長。通過設置不同D1時長，考察定量特征峰面積的穩(wěn)定性，最終確定外標的D1為20 s，樣品的D1為15 s。

2.4.3精密度實驗在“1.2.2”條件下分別測定外標物溶液和樣品溶液的定量信號峰峰面積和脈沖寬度，重復6次，計算精密度。所得鄰苯二甲酸二乙酯、褪黑素和奧美拉唑的相對標準偏差(RSD)分別為0.58%、0.64%和0.42%，表明精密度良好。

表4 樣品中3個化合物的測試結果Table 4 Determination results of three compounds by different methods (mg/g)

2.5 樣品定量測定結果

按照“1.3.1”方法制備6個平行樣品溶液(n=6)，按照“1.4.2”方法進行定量實驗，將得到的90°脈沖寬度和定量峰面積代入公式(1)，計算待測膠囊內含物中3個化合物的含量。按照“1.4.3”所述HPLC法測定樣品中3個化合物的含量。兩種定量方法的測定結果見表4。結果顯示，2種方法的測定結果較為一致，且NMR法定量無需標準物質作參比，操作簡便，更適用于保健食品中非法添加物的定性、定量檢測。

3 結 論

本文采用2D-DOSY等多種NMR技術，對具有減肥功效的保健食品膠囊內容物進行定性分析，鑒定出其中含有鄰苯二甲酸乙酯、褪黑素、奧美拉唑3種主要成分。鄰苯二甲酸二乙酯為藥品包衣材料所含成分，褪黑素具有改善睡眠的作用，奧美拉唑為治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍的西藥，此3種物質均不具有測試樣品聲稱的減肥作用。進一步采用PULCON定量方法測定了3種物質的絕對含量，測定結果與HPLC定量結果基本一致。研究結果表明，2D-DOSY技術具有良好的混合物中單一組分結構分析效果，在一定條件下可以實現(xiàn)混合物體系在“信號維度”的分離，聯(lián)合多種NMR技術及PULCON定量方法，能快速實現(xiàn)混合物中多組分的定性、定量檢測，使NMR信息豐富和對樣品無破壞性的優(yōu)點得以充分體現(xiàn)，為保健食品中非目標成分的快速定性、定量檢測提供了一種重要手段。

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