李麗蓉　張國(guó)平　張曉　王心果　李雙慶

(湖南省蠶?？茖W(xué)研究所　410127)

家蠶微粒子病侵染潛伏期長(zhǎng)、傳播范圍廣，可經(jīng)食下傳染和胚種垂直傳染，是一種制約蠶業(yè)穩(wěn)定健康發(fā)展的傳染性疫病，因此其主要病原——家蠶微孢子蟲孢子成為了蠶種生產(chǎn)上唯一法定的檢疫對(duì)象[1]。自150多年前Louis Pasteur創(chuàng)立母蛾鏡檢法以來，幾經(jīng)改進(jìn)，我國(guó)的蠶種檢疫演變成以母蛾集團(tuán)磨蛾鏡檢為主、成品卵鏡檢為輔的技術(shù)體系。該技術(shù)體系僅靠肉眼觀察判斷，判定的準(zhǔn)確性主要依賴檢疫人員的技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)，人力物力耗費(fèi)比較大。另外，該技術(shù)體系主要以母蛾檢疫結(jié)果來推定蠶種質(zhì)量，屬于間接驗(yàn)證，依賴于兩個(gè)關(guān)系的確定性：一是母蛾與蠶種的對(duì)應(yīng)關(guān)系，二是蠶種帶毒率與母蛾帶毒率的關(guān)系。然而，在實(shí)踐中，前一關(guān)系由于生產(chǎn)者利益和檢疫者職責(zé)的對(duì)立時(shí)有遭到破壞，后一關(guān)系由于病原微孢子蟲來源的多樣性和遺傳的復(fù)雜性變得更加不可確定[2～3]，給現(xiàn)行的母蛾鏡檢判定帶來很多質(zhì)疑。目前，蠶種生產(chǎn)從業(yè)者趨向認(rèn)同成品卵檢測(cè)更符合貿(mào)易交往中產(chǎn)品直接檢驗(yàn)的要求，希望蠶種檢疫的最終判定能以成品卵檢測(cè)為主。而在蠶的整個(gè)發(fā)育過程中，蛾最容易檢出家蠶微孢子蟲孢子，卵最難檢出[4]。因此，家蠶微孢子蟲孢子的生產(chǎn)檢疫需要引進(jìn)新的檢測(cè)技術(shù)，主要是針對(duì)蠶卵的檢測(cè)，既能達(dá)到典型病原鑒別的目的，又能進(jìn)一步提高檢疫的準(zhǔn)確性、代表性和及時(shí)性。

現(xiàn)代生命科學(xué)與分子生物技術(shù)的發(fā)展，為深入開展家蠶微孢子檢測(cè)防控技術(shù)研究提供了有利的條件，已報(bào)道的新檢測(cè)技術(shù)有PCR技術(shù)[5]、熒光定量PCR技術(shù)[6]、LAMP技術(shù)[7]等。其中，LAMP技術(shù)不僅敏感性高、特異性好，而且可視覺直觀檢測(cè)、對(duì)儀器要求相對(duì)較低。目前，市面上已有成型的LAMP試劑盒[8]，能在1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因的有效擴(kuò)增，并配以相對(duì)簡(jiǎn)便的家蠶微孢子DNA提取方法，在實(shí)驗(yàn)室就可肉眼直觀效果。筆者結(jié)合自身技術(shù)水平和工作條件，將LAMP檢測(cè)技術(shù)，與現(xiàn)行的顯微鏡檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，以期獲得LAMP技術(shù)在實(shí)踐中應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)，為蠶種檢疫提升至分子生物技術(shù)水平奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　供試樣品

蠶卵樣品：編號(hào)1～9，為一代雜交種的9個(gè)不同批次。

1.2　主要試劑和儀器

主要試劑：家蠶典型微孢子核酸檢測(cè)試劑盒、SYBR Green I購(gòu)自廣州迪澳生物技術(shù)科技有限公司；溴化乙錠(ethidium bromide，EB)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、Triton X-100、異丙醇(分析純)等均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：恒溫金屬水浴鍋，型號(hào)CHB-202，杭州博日科技有限公司；離心機(jī)，型號(hào)5418R，Eppendorf公司。

1.3　CTAB法提取家蠶微孢子DNA

取蠶卵樣品的研磨液200μL于無菌的1.5mL離心管中，12 000rpm離心5min,棄上清。沉淀用2%CTAB緩沖液400μL重懸，加入20μL蛋白酶K(20mg/mL),然后在振蕩器上振蕩20～30s，55℃水浴4h以上或過夜(隔半小時(shí)振蕩一次)。將酶消化后的抽提液從水浴鍋中取出，室溫下冷卻，加入300μL氯仿，振蕩混勻，12 000rpm離心10min。將上清液倒入新的1.5mL離心管中，加入300μL室溫保存的100%異丙醇溶液混合，上下顛倒后置于4℃保溫1h以上，然后12 000rpm離心10min，棄上清。DNA沉淀用70%乙醇300μL洗滌1～2次，然后將離心管倒置，讓其自然晾干，用30～50μL ddH2O溶解DNA沉淀，4℃冰箱保存過夜后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　LAMP檢測(cè)家蠶微孢子蟲DNA

1.4.1LAMP反應(yīng)體系的配制

反應(yīng)混合液在冰盒上配制，體積(25μL)為：2×Reaction Mix 12.5μL,N.bombycis典型引物混合液 1μL，Bst聚合酶 1μL， DNA模板 2μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。模板DNA加入前需加入15μL的礦物油于反應(yīng)液上層，作為密封液，避免反應(yīng)液的蒸發(fā)及氣溶膠污染。加樣時(shí)確保移液槍槍頭在密封液液面下注入樣品；最后在各反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)頂部加入2μL SYBR Green I，作為顯色液，將管蓋蓋緊。

1.4.2擴(kuò)增反應(yīng)及結(jié)果檢測(cè)

將反應(yīng)管置于恒溫金屬水浴鍋中，63℃恒溫放置60min。最后，將反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)頂部的顯色液彈入反應(yīng)管，與反應(yīng)產(chǎn)物混合。在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化為綠色，說明待測(cè)樣品含有病原微孢子；反應(yīng)產(chǎn)物變?yōu)槌燃t色，則不含有病原微孢子。

2　結(jié)果與分析

蠶卵樣品批次1～9經(jīng)越年保護(hù)和中間感溫處理，冷藏后出庫(kù)至檢測(cè)時(shí)，胚胎階段應(yīng)為戊胚子階段。每份蠶卵樣品各取約40粒的蠶卵經(jīng)液氮研磨，采用1.3的方法制備DNA樣品，再用1.4的方法進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果如圖1。各批次蠶種的母蛾檢毒結(jié)果、成品卵檢毒結(jié)果與LAMP檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比如表1。

圖1　LAMP法檢測(cè)蠶卵樣品1～9

注：1～9為蠶卵樣品批次1～9制備的DNA樣品；+為純N.bombycis孢子DNA對(duì)照；ck為ddH2O對(duì)照。

通過圖1和表1可以看到，LAMP法可以檢測(cè)出蠶卵中微孢子蟲的DNA，同時(shí)母蛾鏡檢、成品卵鏡檢以及蠶卵LAMP檢測(cè)結(jié)果未完全對(duì)應(yīng)，不過，這個(gè)現(xiàn)象是合理存在的。

表1　顯微鏡檢結(jié)果與LAMP檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比

研究表明，家蠶微孢子只有在感染了滋養(yǎng)細(xì)胞而未感染卵細(xì)胞的情況下才能成功發(fā)生經(jīng)卵傳染，而其胚種傳染率又受蠶品種、微孢子的感染程度和感染時(shí)期等因素的影響，大小從0到100%不等[4]；同時(shí),一代雜交種的母蛾和蠶卵檢疫均為抽樣調(diào)查，尤其是蠶卵樣本相對(duì)蠶卵整體來說，容量小，樣本中病卵出現(xiàn)的概率小，造成生產(chǎn)檢測(cè)時(shí)母蛾微孢子蟲孢子的檢出率高于成品卵[9],從顯微鏡檢結(jié)果印證了這個(gè)規(guī)律。

另外，成品卵鏡檢的樣品和LAMP檢測(cè)的蠶卵樣品是分別從各批次蠶卵中取得，兩個(gè)小樣本之間具有一定的獨(dú)立性。筆者曾從一個(gè)重約500g的超毒蠶卵批次分兩次取樣本做成品檢驗(yàn)，即使在如此小范圍，結(jié)果仍是第一次無毒，第二次接近超標(biāo)，而對(duì)第二次抽取的大樣(約10g)再次鏡檢，結(jié)果才與第二次鏡檢相近。

可見在大批量蠶卵中分兩次抽樣存在一定的隨機(jī)性，這極有可能導(dǎo)致此次LAMP檢測(cè)結(jié)果與成品卵鏡檢結(jié)果的個(gè)別不一致。

3　討論

目前，蠶種生產(chǎn)上多用雙目大視野的顯微鏡進(jìn)行家蠶微孢子蟲孢子檢測(cè)，每個(gè)視野觀察到的孢子數(shù)與所檢測(cè)樣品溶液中孢子的濃度有一定的關(guān)系。以我們所用的Leica DM750相差顯微鏡(目鏡16×，物鏡40×)為例，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(0.01mm,1/400mm2)得出其一個(gè)視野下(5×5個(gè)最小格)的溶液體積約為10-5mL,若每個(gè)視野中均觀察到一個(gè)微孢子蟲孢子，則樣品中孢子的濃度為105個(gè)/mL。由此，根據(jù)觀測(cè)結(jié)果推算出此次成品卵鏡檢樣品研磨液中微孢子蟲孢子的濃度大都在2×104個(gè)/mL至105個(gè)/mL的范圍。對(duì)比結(jié)果顯示LAMP檢測(cè)能有效地進(jìn)行鑒別家蠶微孢子蟲DNA。而且，根據(jù)燕薇的研究，家蠶微孢子蟲LAMP法檢測(cè)的靈敏度甚至可達(dá)到10個(gè)/mL[10]，在目前報(bào)道的各種家蠶微孢子蟲孢子檢測(cè)新技術(shù)中，只有LAMP法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到該水平。所以，作為替代顯微鏡檢法的新技術(shù)，LAMP技術(shù)相對(duì)其它方法具有靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。

在作業(yè)流程方面，成品卵鏡檢需要經(jīng)過蠶卵高溫多濕催青、孵化培養(yǎng)、手工制樣、人工看樣等步驟，出具檢疫結(jié)果須耗時(shí)15天以上；LAMP檢測(cè)需要經(jīng)過樣品DNA提取、反應(yīng)體系制備、擴(kuò)增反應(yīng)、顯色觀察等步驟，出具檢疫結(jié)果耗時(shí)不到2天。相比之下，后者可以大大縮短工作時(shí)間，在蠶種即浸用種時(shí)期，更能及時(shí)提供檢疫結(jié)果。另外，目前一個(gè)家蠶微孢子蟲孢子檢疫團(tuán)隊(duì)大致是6名檢疫員加6名臨工組成，每天可以完成1 000到1 800個(gè)樣品的對(duì)檢，成本支出主要是人工費(fèi)、儀器設(shè)備折舊費(fèi)兩項(xiàng)。以LAMP技術(shù)現(xiàn)有操作流程達(dá)到同等工作量估計(jì)其成本，人工費(fèi)和儀器設(shè)備折舊費(fèi)最多維持現(xiàn)狀，增加的試劑費(fèi)則是前二者和的10倍之多,高昂的成本給該技術(shù)的推廣帶來限制。

所以，目前可以應(yīng)用LAMP技術(shù)就有毒樣品進(jìn)行種屬鑒別，區(qū)分典型家蠶微孢子原蟲孢子和其它異種異屬的孢子，減少蠶種生產(chǎn)者因非典型孢子淘汰帶來的損失。而在生產(chǎn)檢測(cè)中大范圍推廣，則需要整合LAMP技術(shù)的操作流程，立足實(shí)現(xiàn)制樣、配制反應(yīng)體系的全自動(dòng)化，大幅降低人工費(fèi)的支出，同時(shí)提高檢測(cè)操作的標(biāo)準(zhǔn)化和穩(wěn)定性；另外，還須大幅降低試劑的生產(chǎn)成本。

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.桑蠶一代雜交種檢驗(yàn)規(guī)程：NY/T 327-1997[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1998.

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