胡玲玲 ， 湯德元 ， 曾智勇，王 彬 ， 黃 濤 ， 龍冬梅 ， 石遠(yuǎn)菊 ， 葉 麗 ， 楊 偉 ， 李 波

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.遵義市紅花崗區(qū)農(nóng)牧局 ， 貴州 遵義 563000)

2016年夏，貴州省某動(dòng)物園國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物黑葉猴4只均出現(xiàn)流涎、喘氣、消瘦、被毛脫落、全身無力等癥狀，其中2只發(fā)病1 d后死亡。該黑葉猴沒有接種過任何疫苗。為弄清病因，于是送檢發(fā)病死亡黑葉猴1只及發(fā)病猴血液2份到我校物動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行確診。根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診黑葉猴為支原體感染、鏈球菌及結(jié)核分支桿菌混合感染引起死亡?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床癥狀

黑葉猴發(fā)病前身體消瘦，被毛脫落、粗亂，發(fā)病后心跳為100次/min、呼吸次數(shù)為79次/min，伴有喘氣、食欲下降、口鼻有半透明黏稠液體流出，同時(shí)出現(xiàn)輕度拉稀現(xiàn)象，隨著病情的發(fā)展發(fā)病黑葉猴出現(xiàn)全身無力、反應(yīng)遲鈍、行走不穩(wěn)、心力衰竭和呼吸衰竭死亡。

2 剖檢變化

剖檢可見病死黑葉猴(10歲左右)腹腔有積液，胃腸充氣、有較厚的腸系膜脂肪覆蓋、胃腸黏膜未見明顯充血和出血；氣管及鼻腔中有大量黏稠液體；肺臟出現(xiàn)不同程度壞死灶及淤血斑(見中插彩版圖1)；肝臟表面有嚴(yán)重瘀斑(見中插彩版圖2)、變脆，邊緣部分出現(xiàn)壞死灶； 腎臟有大面積出血點(diǎn)(見中插彩版圖3)；脾臟色澤變深、變硬；心臟包囊有積液，也有少許瘀斑。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 取死亡黑葉猴的內(nèi)臟及無菌采集的血液進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫箱中厭氧/需氧培養(yǎng) 24 h～48 h觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和菌落特征，然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。結(jié)果在需氧和厭氧環(huán)境下，血瓊脂培養(yǎng)基中均有菌落生成，判定分離菌為兼性厭氧菌，培養(yǎng)24 h后能觀察到灰白色、露滴狀、表面光滑，邊緣整齊的菌落，菌落周圍有明顯的溶血環(huán)。革蘭染色鏡檢可見，藍(lán)紫色圓形、鏈狀革蘭陽性球菌(如圖4)。

3.2 細(xì)菌的生化特性鑒定 分離菌經(jīng) 24 h 純培養(yǎng)后，得到的純培養(yǎng)物接種于微量生化鑒定管中，37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，結(jié)果該分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、淀粉，不能利用6.5%氯化鈉、甘露醇、肌醇、0.1%美藍(lán)牛乳，不液化明膠，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比具有典型的鏈球菌的生化特性，根據(jù)經(jīng)生化試驗(yàn)結(jié)果，再結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)特性，判斷該分離菌為鏈球菌。

圖4 10x100油鏡下的革蘭陽性鏈狀球菌

3.3 藥敏試驗(yàn) 挑取單菌落于1 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)1 h后均勻涂板于血瓊脂平板，而后間隔適當(dāng)距離放置藥敏紙片。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)慶大霉素、林可霉素、阿莫西林、頭孢曲松、氨芐西林抑菌圈直徑<10.00 mm屬低敏；卡那霉素和青霉素抑菌圈均>13.00 mm屬中度敏感；而氧氟沙星抑菌圈為17.50 mm屬高敏。

3.4 支原體PCR檢測(cè) 剖檢采集黑葉猴的肺臟及口腔黏液，適量取樣研磨后反復(fù)凍融3次，勻漿器磨20 min后收集勻漿，12 000 r/min 離心10 min，取上清提取DNA(按支原體PCR檢測(cè)核酸提取試劑盒使用說明書)。用支原體PCR 檢測(cè)試劑盒(購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系為(總體積20 μL) ：16 μL PCR反應(yīng)液，2 μLTapDNA 聚合酶，2 μL 模板 DNA。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物于1% 1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)(90 V，30 min)，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。結(jié)果顯示，病料中檢測(cè)出支原體特異性核酸陽性條帶(圖5)，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符，說明黑葉猴為支原體感染。

3.5 結(jié)核分支桿菌的檢測(cè) 將送檢的2份發(fā)病黑葉猴血樣于4 ℃過夜，8 000 r/min 離心 10 min，分別吸取上清于全新離心管中，標(biāo)記后嚴(yán)格按照結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒(購自福建省明溪海天藍(lán)波生物技術(shù)有限公司)操作說明，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示結(jié)核分支桿菌檢測(cè)呈陽性。

圖5 黑葉猴支原體PCR檢測(cè)

4 確診

根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢診斷及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，確診該動(dòng)物園黑葉猴為支原體、鏈球菌及結(jié)核分支桿菌混合感染。

5 防治

首先對(duì)有臨床癥狀的黑葉猴立即進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，并進(jìn)行針對(duì)性治療。由于支原體無細(xì)胞壁，因此應(yīng)選擇作用于細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的相關(guān)藥物治療效果較好。所以本次對(duì)該動(dòng)物園黑葉猴支原體及鏈球菌混合感染的具體治療方法為：左氧氟沙星1片/次，2次/d；卡那霉素，3～5 mL/次，2次/d；連用5 d；并結(jié)合中藥處方白礬散加減：白礬5 g、白芷5 g、浙貝母5 g、葶藶子5 g、黃連5 g、黃芩5 g、大黃4 g、郁金5 g、甘草5 g、桔梗5 g、紫苑5 g、冬花5 g、水煎后加蜂蜜25 g，每天3次灌服，連用3劑，用藥時(shí)應(yīng)使用足夠劑量與療程。而針對(duì)結(jié)核分支桿菌的感染主要是以預(yù)防為主，加強(qiáng)引進(jìn)檢疫制度，并用卡介苗進(jìn)行預(yù)防接種后，隔離觀察；由于結(jié)核病為人獸共患病，因此加強(qiáng)養(yǎng)殖人員的自身防護(hù)也應(yīng)引起高度重視。此外，患病黑葉猴群除隔離治療以外還需帶猴消毒，并對(duì)被糞便、血液等的污染物及棄尸地、圈舍、用具等用10%漂白粉嚴(yán)格消毒，病死黑葉猴及污染物則徹底焚燒或深埋。糞便堆積后用5%氫氧化鈉液表面消毒后生物熱處理，并對(duì)水源、圈舍等黑葉猴活動(dòng)過的地方用0.5%消特靈進(jìn)行噴灑消毒，1次/d，連續(xù)消毒3 d。

其次對(duì)黑葉猴進(jìn)行免疫接種，能有效的預(yù)防和控制支原體肺炎的發(fā)生；在幼猴1月齡時(shí)進(jìn)行滅活苗的免疫，肌肉注射，每頭接種0.5 mL，2周后加強(qiáng)免疫1 mL，能起到很好的防治效果。