朱天倫 ， 王果帥 ， 徐 磊 ， 陶 婭 ， 楊躍飛 ， 王彥紅

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 揚州 225009 ；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 江蘇 揚州 225009)

2016年12月24日，從揚州大學(xué)動物醫(yī)院收到的送檢20日齡病死豬中分離得到1株疑似水獺漫游球菌的革蘭陽性球菌，經(jīng)分離鑒定，確認(rèn)為水獺漫游球菌。由于水獺漫游球菌能引起人類感染，本研究對臨床中采集到的水獺漫游球菌的藥敏、生化等特性做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2016年12月24日在揚州大學(xué)動物醫(yī)院收到送檢的20日齡病死豬。主訴：飼養(yǎng)170頭，5日齡開始發(fā)病，皮膚發(fā)紅，無拉稀，無呼吸道癥狀。病理變化為皮膚點狀出血，內(nèi)臟無明顯病變。無菌采集病死豬皮膚以及心、肝、脾、肺、腎等組織臟器。

1.2 主要試劑 用市售的普通綿羊血和普通營養(yǎng)瓊脂粉按常規(guī)方法配制成血瓊脂平板，按常規(guī)方法配制的麥康凱瓊脂平板；購自杭州天和微生物試劑有限公司的生化培養(yǎng)管和藥敏試紙。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 采集病死豬的心、肝、脾、肺等組織器官，按常規(guī)無菌操作接種于血瓊脂平板上，置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑選疑似單菌落分別在麥康凱培養(yǎng)基與綿羊血培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。觀察純化菌的生長狀況和形態(tài)特征。

1.3.2 16S rRNA 根據(jù)文獻(xiàn)方法[1]制備細(xì)菌基因組RNA模板，按照16S rRNA Bacterial Identification PCR Kit方法操作，對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，將目的片段切膠后送至金斯瑞生物科技公司進(jìn)行測序。

1.3.3 生化試驗 用接種針挑取純化后的細(xì)菌單個菌落，分別接種于硫化氫、蔗糖、甘露醇、半乳糖、ONPG、山梨醇、木糖醇、尿素、硝酸鹽還原、乙酰葡萄糖胺、甘露糖、麥芽糖、精氨酸、蜜二糖、乳糖、蕈糖、V-R、M.R.、木糖對照生化管內(nèi)反應(yīng)，置37 ℃條件培養(yǎng)24 h，按生化反應(yīng)管說明書進(jìn)行判斷。

1.3.4 小鼠毒力試驗 將培養(yǎng)于血瓊脂平板上的細(xì)菌用生理鹽水溶解后，采用腹腔注射的方式注射菌液，設(shè)置陰性對照組給小鼠腹腔注射生理鹽水。24～48 h后觀察小鼠狀況并進(jìn)行剖檢。

1.3.5 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer藥敏紙片的方法，采用頭孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素這15種藥敏紙片，在無菌條件下，挑取純化后的菌株，在綿羊血培養(yǎng)基涂布均勻，取藥敏紙片貼于平板瓊脂面上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，測量出各抗生素紙片的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 經(jīng)分離純化，從病死豬的心血分離出病料接種于血瓊脂平板培養(yǎng)24 h后生長良好，形成光滑型菌落，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長。

2.2 16S rRNA的PCR擴(kuò)增及序列分析 分離菌的16S rRNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，出現(xiàn)500 bp左右的目的條帶，將所測定的序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST搜索比對，結(jié)果表明，所獲得的序列與已公布的水獺漫游球菌(序列號：DQ395281)的同源性高達(dá)100%。

2.3 生化試驗鑒定 細(xì)菌接種于微量生化反應(yīng)管內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，鑒定結(jié)果符合水獺漫游球菌的生化特性。生化試驗鑒定結(jié)果見表1。

表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果

注: 在糖發(fā)酵試驗中，+表示產(chǎn)酸，-表示不產(chǎn)酸。在其他生化試驗中，+表示陽性，-表示陰性

2.4 小鼠毒力試驗結(jié)果 注射菌液48 h后，試驗組小鼠精神狀況良好。采用頸椎脫臼法處死小鼠，剖檢，器官并無明顯病變。無菌采取小鼠肝臟制觸片，進(jìn)行革蘭染色，未觀察到球菌。

2.5 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果顯示，分離株對美洛西林有較高的敏感性；對丁胺卡那霉素與多粘菌素B有較低敏感性；對頭孢曲松、氟苯尼考、多西環(huán)素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素不敏感。

3 討論

1989年Collins等報道了漫游球菌屬,當(dāng)時只發(fā)現(xiàn)了1個種，為河流漫游球菌[2]，截止至2014年，共發(fā)現(xiàn)8個種[3]。文獻(xiàn)[4]報道了在2005年前發(fā)現(xiàn)的5種漫游球菌，分別為1989年發(fā)現(xiàn)的河流漫游球菌[2](Vagococcusfluvialis)，1990年發(fā)現(xiàn)的鮭魚漫游球菌[5](Vagococcussalmoninarum)，1999年發(fā)現(xiàn)的水獺漫游球菌[6](Vagococcuslutrae)，2000發(fā)現(xiàn)的海豹漫游球菌[7](Vagococcusfessus)和2004年發(fā)現(xiàn)的嗜肉漫游球菌[8](Vagococcuscarniphilus)，其余為Vagococcuselongatus[9](2007)，Vagococcuspenaei[10](2009)和Vagococcusacidifermentans[11](2010)。水獺漫游球菌(Vagococcuslutrae)在1999年由Lawson等從普通水獺皮中分離而來[6]。2015年在法國馬賽市發(fā)現(xiàn)一例由于水獺漫游球菌引起的人類感染，推測感染為食物介導(dǎo)，而此前水獺漫游球菌從未被報道為人類病原體[12]。

水獺漫游球菌是單個、成對或鏈狀排列的革蘭陽性球菌，無芽孢，無動力，兼性厭氧,觸酶陰性[2]。水獺漫游球菌感染會引起嚴(yán)重的皮膚病變，2015年法國馬賽市的水獺漫游球菌人類感染病例，發(fā)現(xiàn)時患病已臥床4月，皮膚損害嚴(yán)重，主要通過阿莫西林治療感染,15日后痊愈。從以上人類感染的病例推測，感染源是由食物介導(dǎo)，由于衛(wèi)生條件差，細(xì)菌跟隨直接排放到床上的糞便一同排出，患者皮膚與之直接接觸后感染[12]，并非由于腸道直接吸收感染。本試驗中分離到的水獺漫游球菌的來源是20日齡死亡的仔豬，從小鼠毒力試驗結(jié)果來看，該菌毒性較弱，并未能引起小鼠死亡，甚至組織器官的明顯病變。因此，推測該菌感染并非引起仔豬死亡的直接原因。

從藥敏試驗結(jié)果來看，水獺漫游球菌對美洛西林有較高敏感性。美洛西林屬于青霉素類抗生素，同時上述人類感染病例治療中使用的阿莫西林也屬于青霉素類抗生素，由此可見，該菌對青霉素類抗生素有較高的敏感性，因此青霉素類抗生素可作為該菌感染治療的首選藥物。文獻(xiàn)[11]中描述該菌對頭孢曲松、慶大霉素、紅霉素等一些廣譜類抗生素均敏感，而本試驗結(jié)果顯示，該菌對廣譜類及大多氨基糖苷類抗生素都有較強(qiáng)的耐藥性，推測該菌在傳播過程中已產(chǎn)生交叉耐藥。因此在抗生素的選擇使用中應(yīng)嚴(yán)格遵守抗生素使用原則，避免細(xì)菌產(chǎn)生更強(qiáng)的耐藥性。

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