金艷丹 ， 栗 慧 ， 張巖蔚 ， 魏 東

(1.河北省農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 張家口 075000 ； 2.河北北方學(xué)院食品安全研究中心 ， 河北 張家口 075000)

鹽酸克倫特羅又稱“瘦肉精”(CL)，是白色或類白色晶體粉狀，無(wú)嗅、味微苦，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，屬于苯乙醇胺類β2腎上腺類神經(jīng)興奮劑。它有較強(qiáng)的藥性，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶解代謝率低，不易排出，殘留量較高，大量用在飼料中可增強(qiáng)脂肪分解，肉迅速增長(zhǎng)，大大提高了瘦肉率，增加瘦肉產(chǎn)量，雖說(shuō)農(nóng)藥、飼料添加劑、動(dòng)物激素等在一定劑量范圍內(nèi)使用，可以為畜牧業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)其在生物體內(nèi)含量超過(guò)臨床用量的5～10倍時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致畜禽中毒和大量藥物殘留，帶來(lái)了相應(yīng)的安全隱患[1]。研究表明，過(guò)多食用含有瘦肉精的肉制品對(duì)人體某些機(jī)能損害極大，易使人出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、嘔吐等癥狀，特別是對(duì)高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡[2]。因此，研究一種高效、快速、簡(jiǎn)捷的檢測(cè)鹽酸克倫特羅類興奮劑藥物殘留的方法是目前關(guān)鍵任務(wù)。

目前, 已經(jīng)有多種技術(shù)可以對(duì)鹽酸克倫特羅瘦肉精殘留進(jìn)行較為靈敏的檢測(cè)。主要有高效液相色譜[3]、微生物法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、膠體金免疫法[6]等，其中高效液相色譜法已成為多個(gè)國(guó)家主要的檢測(cè)方式，但該方法前處理比較復(fù)雜，所需儀器昂貴，難以普及。微生物法檢測(cè)線過(guò)高，靈敏度低，特異性差，適合于初級(jí)的篩選也無(wú)法廣泛適用。酶聯(lián)免疫吸附法目前雖備受關(guān)注但也存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[7]。膠體金層析法雖比其他方法更適用但對(duì)于殘留量較低的半抗原抗體物質(zhì)仍舊很難進(jìn)行定量分析，且很不能用肉眼觀察，極大地限制了他的應(yīng)用[8]。而近年來(lái)新興的半導(dǎo)體納米熒光材料量子點(diǎn)逐漸被人們開(kāi)發(fā)作為熒光材料標(biāo)記抗體，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比激發(fā)光譜寬，顏色可調(diào)，穩(wěn)定性好，熒光強(qiáng)度高[9]。與膠體金相比量子點(diǎn)能檢測(cè)出含量較低的抗原抗體，靈敏度更高，更適用于藥物殘留的基層檢驗(yàn)和大量樣品直接現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[10]。在免疫層析技術(shù)中，量子點(diǎn)與大分子物質(zhì)偶聯(lián)是建立熒光免疫層析法的基礎(chǔ)，因此本試驗(yàn)主要以鹽酸克倫特羅為研究對(duì)象，針對(duì)量子點(diǎn)的熒光性和抗體的生物功能，采用EDC/NHS偶聯(lián)劑將二者共價(jià)偶聯(lián)到一起，并經(jīng)紫外掃描法、熒光掃描、斑點(diǎn)法及免疫法對(duì)二者偶聯(lián)效果進(jìn)行了鑒定，為新型免疫層析法和多殘留檢測(cè)試劑盒的研制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑 鹽酸克倫特羅、碳亞二胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG，Sigma 公司生產(chǎn)；羊血清、鹽酸克倫特羅完全抗原、鹽酸克倫特羅多克隆抗體，河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；水溶性羧基量子點(diǎn)，北京北達(dá)聚邦量子點(diǎn)有限公司生產(chǎn)；TMB單組份顯色液，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純由國(guó)藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，本次試驗(yàn)所用水均為超純水。

1.2 儀器 手持移液器(Research Plus系列)，艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；電子精密天平(JJ323BC)常熟市雙杰測(cè)試儀器廠生產(chǎn)；臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16A)，金壇市儀都儀器有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)(Lambda 365)，韓國(guó)生產(chǎn)；熒光分光光度計(jì)(F-7 000)，日本島津生產(chǎn)；微孔板恒溫孵育箱(ST70-2)，深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；恒溫鼓風(fēng)干燥箱(FX101-3)，上海樹(shù)立儀器儀表有限公司生產(chǎn)；NC膜(0.8 μmol/L)，上海金標(biāo)生物科技有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀(Multiskan Mk3型)，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

2 方法

2.1 量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián) 用注射器取600 μL水溶性羧基量子點(diǎn)溶液(2.5 μmol/L)加入1 mL的PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH值=7.0) 攪拌均勻，邊攪拌邊加入300 μL EDC(6 mg/L),將量子點(diǎn)活化20 min后加入100 μL NHS(6 mg/L)，繼續(xù)28 ℃下攪拌20 min，最后加入750 μL鹽酸克倫特羅多克隆抗體溶液，于28 ℃反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)結(jié)束后將偶聯(lián)物用超濾離心管在12 000 r/min條件下離心3 min，將樣品反復(fù)濃縮純化5次，每次濃縮比不小于10，最后置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中于4 ℃避光保存。

2.2 偶聯(lián)效果的檢測(cè)

2.2.1 紫外分光光度計(jì)分析 將量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體偶聯(lián)物用PBS(pH值=7.0)稀釋到一定濃度，在波長(zhǎng)為400～700 nm范圍內(nèi)用UV3 900紫外掃描儀分別進(jìn)行掃描，觀察量子點(diǎn)和量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物之間吸光度以及吸收光譜的變化。

2.2.2 熒光分光光度計(jì)分析 將量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體偶聯(lián)物用PBS(pH值=7.0)稀釋到一定濃度，激發(fā)波長(zhǎng)為540 nm，狹縫為10 nm，發(fā)射波長(zhǎng)在400～700 nm范圍內(nèi)分別用熒光分光光度計(jì)掃描儀分別進(jìn)行掃描，測(cè)定熒光強(qiáng)度，觀察兩者之間的變化。

2.2.3 斑點(diǎn)印跡法 將6 mg/mL CL-OVA點(diǎn)在NC膜上，干燥后用含3% 羊血清的PBS(pH值=7.0)封閉膜上未反應(yīng)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，放置37 ℃恒溫孵育箱中孵育1h，取出，用PBS或PBST反復(fù)洗滌膜。用相同方法制備2個(gè)印跡膜，干燥后依次滴加QDS-CL和QDS，于 37 ℃ 孵育器中反應(yīng)25 min，用PBS(pH值=7.0)反復(fù)沖洗干凈，用365 nm紫外燈觀察圖像。

2.2.4 熒光免疫學(xué)法 根據(jù)間接熒光免疫分析法測(cè)定已標(biāo)記水溶性羧基量子點(diǎn)的鹽酸克倫特羅多克隆抗體效價(jià)，具體步驟如下：包被、封閉、熒光抗體、二抗、顯色、終止、最后在450 nm下測(cè)OD值。

3 結(jié)果

3.1 紫外光譜圖 圖1為量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的吸收光譜圖。由圖可知，量子點(diǎn)具有較寬的紫外吸收峰，而抗體標(biāo)記后的量子點(diǎn)的紫外吸收峰變得更寬，原因可能是由于量子點(diǎn)標(biāo)記上了抗體后，分子結(jié)構(gòu)及數(shù)量可能發(fā)生了改變，使得吸收峰變得更寬。偶聯(lián)后吸光度也有所增加，原因可能是量子點(diǎn)和抗體在EDC、NHS共價(jià)偶聯(lián)作用下，形成了酰胺鍵，并且形成了核殼結(jié)構(gòu)，降低了量子點(diǎn)表面核電荷數(shù)的減少，消除了一部分非輻射馳豫途徑從而使吸光度增大。

3.2 熒光光譜圖 圖2為圖2量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的熒光光譜圖。由圖可知，用抗體標(biāo)記后的量子點(diǎn)，熒光吸收峰仍然很窄，最大吸收峰從560 nm到560.1 nm，熒光強(qiáng)度由652.3 nm增加到726.4 nm,略有增強(qiáng)。原因可能是由于量子點(diǎn)均勻的標(biāo)記上了鹽酸克倫特羅多克隆抗體，偶聯(lián)物粒徑變大，導(dǎo)致了熒光紅移現(xiàn)象。并且抗體包覆量子點(diǎn)后，其表面產(chǎn)生了一定的鈍化作用，降低了無(wú)輻射躍遷的幾率量子點(diǎn)偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖1 量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的吸收光譜

圖2 鹽酸克倫特羅沙丁胺醇抗體偶聯(lián)前后的熒光光譜

3.3 斑點(diǎn)法 將制備好的NC膜放在三用紫外分析儀中觀察，結(jié)果見(jiàn)圖3所示，左膜在滴加CL-BSA 處有明顯的橙黃色亮斑，右膜在 CL-BSA 滴加處沒(méi)有出現(xiàn)橙黃色亮斑，結(jié)果表明，所制得的量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅多克隆抗體偶聯(lián)后，抗體并沒(méi)有喪失識(shí)別抗原的特異性能力，呈現(xiàn)橙黃色亮斑。而膜2由于NC膜上由于沒(méi)有抗體不能和抗原結(jié)合而被洗滌液洗掉，不顯示亮斑，有點(diǎn)殘留印跡。

圖3 量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的斑點(diǎn)

3.4 免疫學(xué)方法 用水溶性羧基量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅多克隆抗體偶聯(lián)物進(jìn)行間接熒光免疫法所得抗血清效價(jià)略有降低但仍可達(dá)32 000以上(P/N>2.1且P-N>0.2)，同時(shí)OD450值也呈良好的線性關(guān)系。因此說(shuō)明量子點(diǎn)已經(jīng)成功標(biāo)在了鹽酸克倫特羅多克隆抗體上且多克隆抗體的生物活性沒(méi)有受到很大的影響，可為下一步試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

4 討論

4.1 熒光材料的選擇 目前常用的熒光染料有熒光素類、羅丹明類染料、量子點(diǎn)。熒光素的雖然穩(wěn)定性好，量子產(chǎn)率高，但熒光素的斯托克斯位移較小，對(duì)樣品的發(fā)射光比較敏感。羅丹明類染料樣品背景干擾小但熒光產(chǎn)率小，而近年來(lái)新興的半導(dǎo)體熒光納米材料量子點(diǎn)不僅具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光產(chǎn)率高、肉眼易觀察等特性，還容易與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)，偶聯(lián)物穩(wěn)定性較強(qiáng)更適合長(zhǎng)時(shí)間對(duì)半抗原樣品進(jìn)行定量分析。因此本試驗(yàn)選擇量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)染料作為熒光染料標(biāo)記抗體。

4.2 偶聯(lián)方法的選擇 常見(jiàn)的偶聯(lián)方法有靜電吸引法、生物素-親和素法、雙功能連接試劑法。靜電吸引法是通過(guò)正負(fù)電荷的吸引作用將兩個(gè)物質(zhì)連接起來(lái)，該方法需要試劑種類少、操作方法簡(jiǎn)單，而且偶聯(lián)效果也良好，多用于分子生物學(xué)，但需要用到重組技術(shù)儀器設(shè)備比較昂貴，且對(duì)外部環(huán)境較敏感不利于大范圍內(nèi)推廣使用。生物素-親和素法放大了生物素和親和素的共同效應(yīng)，可用于抗原抗體的定量分析，方便快速但其內(nèi)源性生物素的活性不易消除，容易影響結(jié)果。雙功能連接試劑法是采用一種具有2個(gè)或2個(gè)以上特殊基團(tuán)的反應(yīng)末端的雙功能偶聯(lián)劑將蛋白和小分子或者熒光材料連接到一起的方法。常用的交聯(lián)劑有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸硫磺基琥珀酰亞胺脂鈉(sulfo-SMCC)。由于EDC具有很好的活化功能，NHS會(huì)增加基團(tuán)活化，但會(huì)輕微導(dǎo)致熒光淬滅。因此，本試驗(yàn)采用EDC先將量子點(diǎn)上的羧基活化再加入少量NHS，這樣不僅是量子點(diǎn)和抗體更好的結(jié)合，也不會(huì)因?yàn)镹HS過(guò)量導(dǎo)致熒光淬滅，形成較為穩(wěn)定的量子點(diǎn)和抗體偶聯(lián)物

4.3 偶聯(lián)物鑒定方法的選擇 量子點(diǎn)和多克隆抗體偶聯(lián)物鑒定的方法有紫外掃描法、熒光掃描法、斑點(diǎn)印跡法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、免疫學(xué)方法等等，紫外掃描法是指通過(guò)根據(jù)在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描的紫外吸收光譜來(lái)分析量子點(diǎn)及其量子點(diǎn)多克隆抗體的偶聯(lián)物的情況，一般來(lái)說(shuō)量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物由于連上了抗體分子量一定會(huì)有所增加，其吸收光譜也會(huì)發(fā)生一定的變化，因此，來(lái)初步判斷量子點(diǎn)是否成功標(biāo)記在了量子點(diǎn)上；熒光掃描法是量子點(diǎn)及其偶聯(lián)物在同一激發(fā)波長(zhǎng)下使量子點(diǎn)及其偶聯(lián)物在一定范圍內(nèi)發(fā)射一定的波長(zhǎng)后波峰會(huì)發(fā)生一定的改變，熒光強(qiáng)度可能增加或降低來(lái)鑒定偶聯(lián)效果；斑點(diǎn)印跡法實(shí)施根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，使熒光抗體和包被的抗原發(fā)生反應(yīng)，在通過(guò)洗滌除去未反應(yīng)的分子，最后通過(guò)觀察顏色變化來(lái)進(jìn)一步判斷量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法是依靠表面活性劑十二烷基硫酸鈉(C12H25-OSO3Na)，將蛋白質(zhì)的某些氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，去掉電荷效應(yīng)最后根據(jù)遷移率得出分子量，鑒定抗體上是否偶聯(lián)了量子點(diǎn)；瓊脂糖凝膠電泳依據(jù)它自身產(chǎn)生的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)以瓊脂糖作為電泳介質(zhì)。根據(jù)不同電荷在電場(chǎng)中受力不同而產(chǎn)生不同的泳道把物質(zhì)分開(kāi)來(lái)鑒別是什么物質(zhì)；免疫學(xué)方法是通過(guò)間接法來(lái)測(cè)定偶聯(lián)抗體的效價(jià)，來(lái)分析量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)是否成功。因?yàn)殡娪痉ú僮鲿r(shí)間長(zhǎng)且過(guò)程繁瑣到導(dǎo)致操作起來(lái)不方便且毒性大，所以本試驗(yàn)綜合各方面考慮選擇了紫外熒光掃描法、熒光掃描法、斑點(diǎn)印跡法、免疫學(xué)這4種方法來(lái)鑒定量子點(diǎn)是否成功標(biāo)記在了鹽酸克倫特羅多克隆抗體上。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)EDC(碳亞二胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)偶聯(lián)劑的活化作用將純化后的CdTe/ZnS量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅多克隆抗體共價(jià)偶聯(lián)成熒光復(fù)合物，并經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)分別掃描其最大吸收峰、熒光分光光度計(jì)掃描其發(fā)射峰和熒光強(qiáng)度、斑點(diǎn)法觀察抗原抗體特異性結(jié)合現(xiàn)象鑒定了水溶性羧基量子點(diǎn)穩(wěn)定的熒光特性，抗體的生物活性，證明了量子點(diǎn)成功標(biāo)記了抗體，總之，本次研究結(jié)果可進(jìn)行下一步試驗(yàn)，為多殘留檢測(cè)試劑盒和試紙條應(yīng)用研究提供了重要的依據(jù)。

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