齊 宇 ， 蔣依倩， 扈榮良， 管 巖， 張英海， 張迎志， 張國軍

(1.吉林和元生物工程股份有限公司 ， 吉林 松原 138000 ； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 ， 吉林 長春 130112 ；3.山東省諸城市畜牧局 ， 山東 諸城 262200 ； 4.河北省樂亭縣畜牧局 ， 河北 唐山 063600)

貉(N.procyonoides)，屬于食肉目、犬科動(dòng)物，其皮張具有針毛長、底絨豐厚，保溫力強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國重要的毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖種類之一。近年來，由于貉皮在國際毛皮市場中價(jià)格不斷上漲，我國貉養(yǎng)殖數(shù)量也隨之增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014-2015年我國貉養(yǎng)殖存欄總量均高達(dá)2 500萬只以上[1]，其毛制品大量出口，為養(yǎng)殖者帶來豐厚的經(jīng)濟(jì)效益。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的擴(kuò)大，各類傳染病的感染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加。

本試驗(yàn)從山東某貉養(yǎng)殖場疑似患細(xì)小病毒性腸炎的貉腸道中成功分離出1株RDPV，并對其VP2基因進(jìn)行了序列分析，為貉細(xì)小病毒性腸炎的流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對了解貉細(xì)小病毒病的抗原變異情況及其防控具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 病料采集及處理 采自山東諸城某貉養(yǎng)殖場疑似患細(xì)小病毒性腸炎死亡的貉子腸道組織。加入3倍體積生理鹽水充分研磨制成組織勻漿，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5 min，取上清加入等體積氯仿混勻，室溫作用30 min，10 000 r/min (4 ℃)離心20 min取上層水相，過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞株及試劑 貓腎細(xì)胞(F81)。ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T載體、BamHI、XhoI和DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自上海寶生物有限公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自康寧公司。

1.3 病毒培養(yǎng) 采用同步接毒的方式，按照體積比1∶10同步接入病料處理液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，并設(shè)置正常細(xì)胞對照，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)情況。若有CPE出現(xiàn)則初步判為陽性，并在細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)收毒。

1.4 PCR鑒定 出現(xiàn)CPE后，將病毒繼續(xù)培養(yǎng)至第5代，取細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2次為樣品，按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組。參照周云朵等[3]建立的肉食獸細(xì)小病毒檢測方法進(jìn)行PCR檢測。

1.5 病毒的形態(tài)學(xué)觀察 將病毒液經(jīng)10 000 r/min (4 ℃)離心10 min，取上清液加入0.5%磷鎢酸溶液染色，用電鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征。

1.6 病毒組織細(xì)胞半數(shù)感染量TCID50測定 CPV陽性第5代細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融后取上清液依次做10倍稀釋，分別接種于F81細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)，0.1 mL/孔，設(shè)正常細(xì)胞為對照組，觀察至120 h，記錄病變孔數(shù)目，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.7 VP2引物合成 參考GenBank中已發(fā)表的貉源細(xì)小病毒VP2全基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對引物，VP2-F：5′-CGGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAA-3′, VP2-R：5′-CCGCTCGAGTTAATATAATTTTCTAGGTGCT-3′。其中上游引物引入BamHI 酶切位點(diǎn)，下游引物引入XhoI 酶切位點(diǎn)。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.8 VP2基因PCR擴(kuò)增與克隆質(zhì)粒構(gòu)建 提取的病毒基因組為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。按照膠回收試劑盒說明書方法回收VP2基因PCR產(chǎn)物，并與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒DNA，利用BamHI 和XhoI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒送往吉林省庫美生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果 正常細(xì)胞邊緣清晰，形態(tài)統(tǒng)一(圖1A)；接種病毒后的F81細(xì)胞，在第72 h開始出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、腫脹、聚集成團(tuán)，邊緣細(xì)胞形態(tài)細(xì)長，細(xì)胞間隙變大，呈抽絲拉網(wǎng)樣病變(圖1B)。

2.2 PCR鑒定結(jié)果 利用肉食獸細(xì)小病毒通用引物對分離株病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期片段大小相符的目的條帶(圖2)。

圖2 腸道組織PCR特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 病毒形態(tài)觀察結(jié)果 病毒經(jīng)磷鎢酸染色后，通過透射電鏡觀察可見到典型的細(xì)小病毒病毒粒子，直徑約20 nm，呈圓形或卵圓形，將病毒命名為RDPV-SD1607株。

2.4 毒力測定結(jié)果 按照Reed-Muench法計(jì)算RDPV-SD1607株分離毒的TCID50為1.0×10-4.5/mL。

2.5 VP2基因序列測定與遺傳進(jìn)化分析 提取RDPV-SD1607株基因組，進(jìn)行VP2全基因的PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆、酶切鑒定(圖3)后送往吉林省庫美生物科技有限公司測序，并對序列結(jié)果進(jìn)行整理拼接，得到RDPV-SD1607株VP2全基因序列，長度為1 755 bp。與GenBank中肉食獸細(xì)小病毒核苷酸相似性在97.44%～99.49%。將RDPV-SD1607與其他24株不同來源的肉食獸細(xì)小病毒VP2基因序列進(jìn)行分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒pMD18T-VP2 PCR及酶切鑒定

3 討論

貉細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬成員。病毒粒子無囊膜，不含糖和脂類，結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)緊密，因此該病毒對外界理化因素具有非常強(qiáng)大的抵抗力，可在自然界長期存活并廣泛傳播。雖然細(xì)小病毒是DNA病毒，但它卻與RNA病毒類似，基因突變率特別高，許多新的亞型不斷被發(fā)現(xiàn)[5]。1894年我國首次報(bào)道了貉細(xì)小病毒性腸炎，但直到1988年才首次分離到貉細(xì)小病毒[6]。2009年，閆喜軍等[7]從遼寧、河北省地區(qū)分離到6株CPV-2型貉細(xì)小病毒。同年，劉雙翼等[8]從大慶地區(qū)分離到8株CPV-2 c型貉源細(xì)小病毒。

細(xì)小病毒屬成員核衣殼蛋白結(jié)構(gòu)相似，均由VP1、VP2、VP3構(gòu)成。其中VP2蛋白是細(xì)小病毒衣殼蛋白的重要組成成分，幾乎包含了病毒所有的中和抗原表位[9]。VP2蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的改變可以引起細(xì)小病毒的抗原特性、細(xì)胞嗜性及宿主范圍發(fā)生變化。研究表明，細(xì)小病毒在不同pH值緩沖液中的血凝性與VP2蛋白323位氨基酸殘基相關(guān)。當(dāng)FPLV的VP2蛋白323位殘基為Asn時(shí)，在pH值高達(dá)7.5時(shí)仍表現(xiàn)出血凝性；而當(dāng)CPV的323位殘基為Asp時(shí)，只能在pH值6.6以下才能表現(xiàn)出血凝性[10]。VP2蛋白第300位氨基酸殘基則是影響CPV感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵位點(diǎn)。2015年，Andrew等[11]發(fā)現(xiàn)，從浣熊體內(nèi)分離的CPV變異株不能感染犬細(xì)胞，而當(dāng)其VP2蛋白300位氨基酸殘基由Asn變?yōu)锳la時(shí)就能有效地結(jié)合犬細(xì)胞表面的TfR，從而感染犬細(xì)胞。雖然肉食獸細(xì)小病毒屬各成員間親緣關(guān)系較近，抗體具有交叉保護(hù)性，但即使是與RDPV親緣關(guān)系最近的CPV-2相比，VP2蛋白中部分氨基酸仍有差異，這些差異對RDPV的抗原特性的影響，仍有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)從貉腸道中成功分離出一株RDPV并對其VP2全基因序列進(jìn)行了測序及分析，且與國內(nèi)外發(fā)表的犬細(xì)小病毒分離株、犬細(xì)小病毒疫苗株、貉細(xì)小病毒分離株、浣熊細(xì)小病毒分離株、水貂細(xì)小分離株、貓細(xì)小病毒分離株、狐細(xì)小病毒分離株進(jìn)行了同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， RDPV-SD1607的VP2基因片段長度為1 775 bp，與FPLV和MEV相比，該分離株VP2基因與CPV具有更高的同源性，核苷酸同源性均在99.0%以上，且與RDPV-HB3(GenBank登陸號為GU392240)分離株的同源性最高，達(dá)99.49%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明， RDPV-SD1607位于細(xì)小病毒CPV-2亞型和CPV-2a亞型聚類分支之間，推測其可能正處于CPV-2亞型向CPV-2a亞型進(jìn)化的中間狀態(tài)，或是CPV適應(yīng)貉而形成的新毒株。將該分離株與9個(gè)參考毒株VP2蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸[12-13]進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與RDPV-HB3、CPV-Cv、CPV-Vac 1株關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸一致，判定該分離株屬于CPV-2型。推測可能是由于多數(shù)養(yǎng)殖場對犬使用犬細(xì)小病毒弱毒疫苗(CPV-2型)進(jìn)行免疫，免疫后的犬持續(xù)排毒，CPV-2弱毒株在易感動(dòng)物間傳播過程中毒力返強(qiáng)，身為CPV-2易感動(dòng)物的貉，因接觸了含細(xì)小病毒的糞便而感染發(fā)病。

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