李凌浩，馬 鵬，李林杰,，常秋燕，郭富城，王悅縈,馬忠仁，李 倬，馬曉霞

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院/西北民族大學(xué)甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730030)

單純皰疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)屬于皰疹病毒科α病毒亞科，是一種DNA病毒。HSV具有神經(jīng)細(xì)胞嗜性，可以潛伏在神經(jīng)細(xì)胞中，處于潛伏感染。 HSV感染是宿主免疫應(yīng)答抵抗HSV感染靶細(xì)胞的結(jié)果，這導(dǎo)致HSV復(fù)制活動的中止以及相關(guān)病毒基因表達(dá)的沉默。雖然目前一些利用特異性抗體來進(jìn)行HSV感染病例的臨床治療在試驗(yàn)嘗試階段[1]，但是宿主免疫反應(yīng)是如何導(dǎo)致HSV從復(fù)制階段轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲A段的還有很多尚未明確的疑點(diǎn)，似乎HSV的潛伏-復(fù)制階段的切換是處于一種動態(tài)平衡中[2-4]。攜帶HSV-1和HSV-2的患者一般是經(jīng)過口腔或者生殖道存在的病毒進(jìn)行傳染的，在這種狀態(tài)下無任何臨床表現(xiàn)[5-7]。但是最新研究表明，當(dāng)一種乳酸桿菌 (Lactobacilluscrispatus)吸附在哺乳動物細(xì)胞表面時，可以有效干擾HSV對靶細(xì)胞的侵染[8]。當(dāng)HSV進(jìn)入一個新的易感環(huán)境中，HSV首先在上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制(特別是在口和生殖道)，1 d～3 d內(nèi)，HSV可在上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行100倍～10 000倍的增殖，然后傳播到神經(jīng)末梢。一旦HSV感染神經(jīng)末梢，在受神經(jīng)支配的神經(jīng)節(jié)內(nèi)，通過逆轉(zhuǎn)運(yùn)方式將核衣殼從軸突運(yùn)送到神經(jīng)細(xì)胞體幾厘米遠(yuǎn)的地方[9]。感染期達(dá)到3周后，HSV復(fù)制活性將會顯著減弱，此階段被稱為潛伏感染。神經(jīng)元是HSV潛伏感染的存儲器，神經(jīng)元獨(dú)特的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)是HSV建立潛伏感染的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。多種神經(jīng)特異性調(diào)制因子(諸如Oct-2、Zhangfei和CoREST)是調(diào)節(jié)HSV感染從復(fù)制期進(jìn)入潛伏期的一些物質(zhì)基礎(chǔ)[11-14]，此外，HSV在神經(jīng)元細(xì)胞中的復(fù)制相對于在上皮細(xì)胞中復(fù)制是相當(dāng)困難的。如果上皮細(xì)胞和神經(jīng)元對HSV復(fù)制上存在本質(zhì)的嗜性差別，這些差別本應(yīng)該反映了感染性HSV的數(shù)量，但是在HSV初級感染過程中，病毒數(shù)量取決于上皮細(xì)胞與其受支配的神經(jīng)節(jié)比值。HSV-1的復(fù)制活動主要發(fā)生在三叉神經(jīng)的神經(jīng)元中[15]。但是毋庸置疑，宿主細(xì)胞中的一些蛋白因子在DNA病毒復(fù)制的過程中發(fā)揮著重要作用[16]。

1 天然免疫在HSV感染中的作用

在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，CD8+T細(xì)胞與HSV感染的建立存在直接的相互關(guān)系。特別是在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，CD8+T細(xì)胞對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的浸潤可能是導(dǎo)致HSV復(fù)制停止的重要因素。此外，當(dāng)HSV感染傳播未經(jīng)過外周神經(jīng)系統(tǒng)時，CD8+T細(xì)胞不能被及時招募到神經(jīng)節(jié)，病毒會對神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行快速且大規(guī)模的破壞。進(jìn)一步研究表明，HSV復(fù)制的T細(xì)胞依賴性抑制不受神經(jīng)元細(xì)胞生理狀態(tài)的影響，并且T細(xì)胞在HSV感染早期可以高效對其病毒相關(guān)抗原進(jìn)行清除[17]。此外，自噬也是抗擊DAN病毒最有效的一種防御手段，這是通過HSV誘導(dǎo)細(xì)胞SUN結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員 (tripartite motif,TRIM)來實(shí)現(xiàn)的，這有助于避免HSV感染破壞組織后機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)加深對機(jī)體組織的破壞程度。最近，科研人員針對HSV-2 的特異性CD8+T細(xì)胞開展了效應(yīng)因子CCR10與CXCR3的選擇性表達(dá)，并且在抗擊HSV-2侵染的過程中取得了很好的效果[18]，這也為降低由于HSV感染對機(jī)體組織損傷帶來了新的途徑。

HSV感染并破壞上皮細(xì)胞后，上皮組織完整性遭到破壞，機(jī)體將自動開啟自愈模式。自愈前期是通過急性炎癥細(xì)胞如多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leucoytes,PMNs)和長效專職抗原遞呈細(xì)胞(long-lived professional antigen presenting cells,APCs)來清除細(xì)胞碎片。在吞噬死亡細(xì)胞的過程中，PMNs和APCs分泌一系列的化學(xué)趨化因子和細(xì)胞因子，這些因子加速了炎癥過程，從而導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性降低，促進(jìn)免疫介質(zhì)從脈管系統(tǒng)移出進(jìn)入到組織損害位點(diǎn)[19-21]。當(dāng)專職性抗原遞呈細(xì)胞 (MHC Ⅱ類分子陽性細(xì)胞) 游走到受損組織周圍時會將病原的抗原肽進(jìn)行遞呈，并且富集抗原肽，而后攜帶所遞呈特定抗原肽的APC回流到附近淋巴結(jié)后，將抗原肽遞呈給T和B淋巴細(xì)胞[22-23]。在這個感染和修復(fù)過程中，促炎性細(xì)胞因子如白介素1 (interleukin 1，IL-1) 和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)以及趨化因子，如CXCR-3、 CXCL-10和IL-8，使白細(xì)胞通過血流進(jìn)入病毒復(fù)制灶點(diǎn)和組織損害位點(diǎn)來清除受損組織細(xì)胞[24-26]。HSV的糖蛋白M在病毒侵染細(xì)胞形成合胞體的過程中發(fā)揮著重要作用，這一機(jī)制也為研究天然免疫抗擊HSV侵染提供了新的思路[27]。

干擾素(interfron，IFN)除了具有抗病毒作用外，在免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮重要作用。IFN促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。另外，IFNγ可使巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)增加(10倍～20倍地增加),增強(qiáng)其抗原遞呈能力，這增強(qiáng)了抗體的抗病毒免疫反應(yīng)，MHCⅡ類分子肽結(jié)合槽的兩端呈開放狀，能容納10個～30個氨基酸殘基的肽段，遞呈給CD4+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞依次促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化。在IFN拮抗HSV侵染的過程中，NF-κB和p65蛋白介導(dǎo)的免疫信號通路是調(diào)節(jié)相關(guān)免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)路徑[28]。

2 適應(yīng)性免疫在HSV感染中的作用

2.1 B淋巴細(xì)胞的作用

當(dāng)HSV侵染機(jī)體初期， IgM會快速的由B淋巴細(xì)胞爆發(fā)式產(chǎn)生，產(chǎn)生IgM是產(chǎn)生其他抗體同型體的初級階段，細(xì)胞因子和B細(xì)胞受體重鏈基因遺傳重排引起的抗體類別轉(zhuǎn)換會產(chǎn)生其他類型的抗體。抗體的類別轉(zhuǎn)換涉及了編碼IgM重鏈外顯子的缺失，這個缺失使B細(xì)胞選擇性地應(yīng)用編碼IgA、IgE或IgG重鏈的3鏈外顯子，這樣在HSV感染初期，特異性IgM抗體在血清中3 d～5 d就能檢測出來，而HSV特異性IgG抗體開始累積，至少需要7 d的時間。HSV特異性IgM抗體是HSV初級感染的確診標(biāo)志。在宿主抵抗HSV感染的防御過程中，HSV特異性IgM抗體并不發(fā)揮主要的功能，因?yàn)镮gM不能擴(kuò)散到病毒感染的組織中。由于IgM抗體的半衰期較短，通過特異性分化成長效的記憶淋巴細(xì)胞，這就出現(xiàn)了當(dāng)IgM滴度下降的時候，特異性IgG的滴度會迅速上升。HSV特異性IgG可降低HSV感染的發(fā)生和傳播，但是不足以抑制皰疹病毒感染的復(fù)發(fā)，HSV感染無癥狀攜帶者在其生命周期中維持很高的HSV特異性的IgG抗體水平，因此在整個時期維持著HSV特異性的IgG抗體水平。

2.2 T淋巴細(xì)胞的作用

習(xí)慣上將CD4+T細(xì)胞稱為“輔助性T細(xì)胞”，是因?yàn)樗軒椭痛龠M(jìn)抗體反應(yīng)和對外源抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。用HSV-2疫苗進(jìn)行肌肉注射，IL-17可以激活Ⅰ型輔助性T細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)方面的作用[29]。激活HSV感染過程中，HSV特異性的CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)抗體的類別轉(zhuǎn)換，并促進(jìn)隨后的HSV特異性B細(xì)胞分化為長期記憶細(xì)胞。同樣，HSV特異性CD4+T細(xì)胞促進(jìn)HSV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，分化成各種免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而破壞HSV感染細(xì)胞以及分泌阻止HSV復(fù)制的各種細(xì)胞因子。CD8+T細(xì)胞被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTLs)，可殺死病毒感染的靶細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞也可能通過分泌IFN-γ來控制病毒感染，干擾病毒復(fù)制，但并不危害宿主細(xì)胞的正?；钚浴?/p>

3 干擾素在HSV感染中的作用

幾乎所有哺乳動物細(xì)胞均可產(chǎn)生不同水平的IFN，作為抗擊病原體侵染機(jī)體的重要防線。產(chǎn)生IFN-α的白細(xì)胞似乎是IFN-α/β的主要來源，它可在活體內(nèi)限制HSV的傳播[30-31]。在眼角膜上皮細(xì)胞中存在的E3泛素化連接酶三基序蛋白32(E3 ubiquitin ligase tripartite motif protein 32)可以正調(diào)控HSV誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β含量，從而抗擊HSV的侵染[32]。對于IFN-γ而言，狀態(tài)就更為復(fù)雜，在宿主抵抗HSV的免疫反應(yīng)中，IFN-γ發(fā)揮的作用受到T細(xì)胞的生物學(xué)性狀和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的動力的影響?；罨腃D8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ作為與感染病毒的細(xì)胞接觸為信號，通過與展示出8～10氨基酸病毒多肽于細(xì)胞表面的MHCⅠ分子與T細(xì)胞抗原受體結(jié)合啟動初級免疫應(yīng)答。在初次感染HSV的個體中，形成特異性抗擊HSV侵染的T細(xì)胞的幾率非常低(1/100 000)。直到感染5 d ～8 d后，HSV特異性CD8+T細(xì)胞才有助于宿主控制HSV感染。特異性識別HSV的CD8+T細(xì)胞連續(xù)進(jìn)入淋巴結(jié)，將在其中擴(kuò)殖。HSV特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目從10倍增加到300倍，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫壓力促使HSV感染進(jìn)入潛伏期。

CD8+T細(xì)胞可能控制了HSV在神經(jīng)元的復(fù)制，其原因可能是由于CD8+T細(xì)胞分泌合成IFN-γ抑制HSV的深入侵染。直接的證據(jù)為當(dāng)T細(xì)胞浸潤HSV感染的神經(jīng)節(jié)時，HSV會在神經(jīng)元細(xì)胞中停止復(fù)制。在多項(xiàng)研究中均可觀察到CD8+T細(xì)胞與神經(jīng)元發(fā)生直接接觸，但神經(jīng)元在外觀上仍保持健康狀態(tài)，這表明CD8+T細(xì)胞依賴非溶細(xì)胞機(jī)制控制HSV在神經(jīng)元的復(fù)制。令人驚訝的是在急性感染消退后，活化的CD8+T細(xì)胞仍可在HSV感染的神經(jīng)節(jié)內(nèi)存留數(shù)月之久。在HSV潛伏感染部位，CD8+T細(xì)胞持續(xù)分泌IFN-γ的現(xiàn)象,可能說明HSV仍然在潛伏感染部位低量復(fù)制，從而維持了針對HSV特異性的CD8+T細(xì)胞的免疫學(xué)活性。但是HSV-1針對CD8+T細(xì)胞侵染是由于病毒蛋白VP11/12通過磷酸化途徑將細(xì)胞蛋白Dok-2降解后發(fā)生的[33]，將會促進(jìn)患者病毒性腦炎的形成[34]。雖然IFN-α/β和IFN-γ信號通路介導(dǎo)的受體彼此具有高度的獨(dú)立性，但是當(dāng)IFN-α/β和IFN-γ受體能夠以1∶1的比例混合時，可以發(fā)生免疫共沉淀。IFN-α/β受體和IFN-γ受體的共激活能夠抑制HSV在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制。這是因?yàn)镠SV侵染激活I(lǐng)FN系統(tǒng)后，天然免疫與適應(yīng)性免疫實(shí)現(xiàn)互作，一些IFN-γ小分子配體結(jié)合到IFN-γ受體上，便可直接提高IFN-α/β的抗病毒作用。在抵抗HSV侵染過程中，Ⅲ型IFN所發(fā)揮的顯著抗病毒作用是不可忽視的，而Ⅲ型IFN針對HSV的抗病毒作用是由調(diào)節(jié)子23復(fù)合物 (mediator complex 23)與干擾素刺激轉(zhuǎn)錄因子7 (interferon-responsive transcription factor 7)的互作實(shí)現(xiàn)的[35]。

4 HSV毒力相關(guān)蛋白在免疫反應(yīng)中的作用

HSV可以產(chǎn)生一種神經(jīng)毒力因子，該因子是由病毒基因組中RL1基因編碼的，后來又被稱為ICP34.5基因。ICP34.5蛋白能與細(xì)胞蛋白磷酸酶1發(fā)生相互作用,并刺激真核翻譯起始因子eIF-2α磷酸化，從而阻止細(xì)胞中相關(guān)蛋白的合成。在體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，RL1基因的缺失很容易導(dǎo)致缺失株自帶病毒復(fù)制的停止，容易使HSV在神經(jīng)元中建立潛伏感染。事實(shí)上，缺失ICP34.5的HSV很容易在神經(jīng)元建立潛伏感染，高劑量的ICP34.5缺失毒株可被注入到患者的腦腫瘤中用作后期治療的手段。由于缺失ICP34.5的HSV不能在健康人的神經(jīng)元中進(jìn)行復(fù)制，因此在不損傷腦膠質(zhì)瘤患者的健康腦組織的情況下這些溶瘤病毒可以選擇性的破壞癌細(xì)胞。HSV產(chǎn)生的ICP0和ICP34.5毒力蛋白可抵抗體外干擾素的抗病毒作用。HSV對IFN-α/β的拮抗過程是一個病毒自身活化的過程，主要依賴于ICP0和ICP34.5毒力因子的合成。其中，ICP34.5蛋白通過控制干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulator factor 3)來抑制IFN的生成，并且刺激可以拮抗IFN的相關(guān)蛋白因子的合成[36]。野生型HSV在未經(jīng)IFN-α/β處理細(xì)胞上的復(fù)制率是被IFN-α/β處理后的細(xì)胞中的復(fù)制率的3倍。與此相反，缺失ICP0編碼基因的HSV缺失株在未經(jīng)處理的細(xì)胞上的復(fù)制率是在IFN-α/β激活細(xì)胞上復(fù)制率的300倍。同樣，缺失ICP34.5編碼基因的HSV缺失株也表現(xiàn)出相似的IFN-敏感性表型。重要的是，當(dāng)突變HSV 30個輔助基因中的其中任何一個，干擾素敏感型都成為非特異性表型；在培養(yǎng)細(xì)胞中，在VP16、ICP22、UL7、UL13和VHS基因上的突變均不會影響HSV抵抗IFN-α/β誘導(dǎo)的阻遏[37]。而HSV含有的Us2基因的表達(dá)產(chǎn)物是可以靶向TAK1調(diào)節(jié)因子來控制NF-κB介導(dǎo)的信號通路，從而影響IFN的產(chǎn)生[38]。

5 結(jié)語

研究表明，宿主干擾素系統(tǒng)對HSV在調(diào)節(jié)自身潛伏感染或復(fù)制的平衡中發(fā)揮著重要作用。針對干擾素是如何調(diào)節(jié)在HSV感染過程中的潛伏-復(fù)制動態(tài)平衡，將有助于研究人員深入理解HSV感染的分子機(jī)制。