祁 鑫，蔣桃珍，李偉杰

(1.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)是一種人獸共患病病原菌，不但能夠感染多種家禽、家畜和野生動(dòng)物，而且可以感染人，主要引起呼吸系統(tǒng)疾病、局灶性感染及出血性敗血癥，導(dǎo)致的疾病包括禽霍亂、豬萎縮性鼻炎及肺炎、牛出血性敗血癥及肺炎、兔出血性敗血癥以及人的皮膚壞死等，嚴(yán)重威脅動(dòng)物及人類健康[1]。不同型的多殺性巴氏桿菌與其導(dǎo)致的疾病存在一定的關(guān)聯(lián)，因此開展多殺性巴氏桿菌流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分型顯得尤為重要。

多殺性巴氏桿菌的分型方法主要包括血清學(xué)分型方法和分子分型方法，前者主要包括Carter分型和Heddleston分型[2-3]，后者主要包括莢膜多重PCR分型方法[4]、脂多糖多重PCR分型方法[5]、多位點(diǎn)序列分型方法(multilocus sequence typing，MLST)[6]、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)[7]、全基因組測(cè)序(whole genome sequence，WGS)[8]等。本文就多殺性巴氏桿菌的分型方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為臨床多殺性巴氏桿菌流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

1 血清學(xué)分型方法

多殺性巴氏桿菌的血清學(xué)分型方法包括基于間接血凝試驗(yàn)的Carter分型和基于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的Heddleston分型，分別依據(jù)莢膜抗原和脂多糖抗原的差異，前者分為A、B、D、E和F共5種血清群，后者分為1～16共16種血清型[9]。通常將兩者結(jié)合起來表示多殺性巴氏桿菌的血清型，例如A∶1、B∶2等。多殺性巴氏桿菌的不同血清型與其所致的疫病有一定的關(guān)聯(lián)，但不同血清型之間的交叉免疫保護(hù)較低，因此血清學(xué)分型方法的建立和應(yīng)用對(duì)于流行病學(xué)的調(diào)查以及后續(xù)疫苗的研發(fā)具有重要的意義。但血清學(xué)分型方法基于細(xì)菌的表型特征，培養(yǎng)條件會(huì)影響這些表型特征的表達(dá)，從而降低鑒定的穩(wěn)定性和可靠性，而且血清學(xué)方法操作繁瑣，對(duì)抗血清的特異性有很高的要求，不適宜臨床大規(guī)?？焖龠M(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。

2 基于莢膜編碼區(qū)的多重PCR分型方法

針對(duì)Carter分型中不同血清群多殺性巴氏桿菌的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，編碼莢膜的基因成簇存在[10]，按照功能的不同分為3個(gè)區(qū)域，分別與莢膜多糖的輸出、莢膜多糖的合成、莢膜多糖的磷脂替換有關(guān)，在不同血清型的多殺性巴氏桿菌中，區(qū)域2存在一定的差異，其他2個(gè)區(qū)域較為保守[4]。血清群A、D和F莢膜多糖合成相關(guān)區(qū)域均含有4個(gè)編碼基因(hyaE、D、C、B，dcbE、F、C、B，fcbE、D、C、B)，其中dcbF基因?yàn)檠錎群菌株所特有，血清F群菌株的fcbD基因與血清A群菌株hyaD基因同源性為82%；血清群B和E均含有9個(gè)編碼基因(bcbA、B、C、D、E、F、G、H、I，ecbA、B、J、K、D、E、F、G、I)，其中ecbJ基因?yàn)檠錏群菌株獨(dú)有，血清E群菌株的ecbD基因與血清B群菌株的bcbC基因同源性只有23%[4]?；谝陨匣虻牟煌稽c(diǎn)，Townsend K M等[4]建立了多殺性巴氏桿菌莢膜分型的多重PCR方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確快速等特點(diǎn)，結(jié)果能夠與Carter分型相對(duì)應(yīng)，目前已完全取代Carter分型，在多殺性巴氏桿菌所引起的疾病的臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用[11-12]。我國豬群中流行的多殺性巴氏桿菌主要為A群和D群，雞群中流行的多殺性巴氏桿菌主要為A群。我國現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽霍亂(禽巴氏桿菌病)診斷技術(shù)NY/T 563—2016》、《豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)NY/T564—2016》也將此方法列入標(biāo)準(zhǔn)中。該方法存在的不足之處是部分菌株無法定型[13]。

3 基于脂多糖外核編碼基因簇的多重PCR分型方法

多殺性巴氏桿菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)主要包括內(nèi)核和外核兩部分，內(nèi)核由類脂A和核心低聚糖組成，外核由側(cè)鏈低聚糖組成[14]。Harper M等[15]對(duì)Heddleston 1～16型多殺性巴氏桿菌參考菌株的LPS組裝基因序列分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株的LPS具有高度保守的內(nèi)核和可變的外核。外核主要由不同數(shù)量的葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺以及庚糖等通過一系列的轉(zhuǎn)移酶連接組成[14]。與LPS外核合成和組裝相關(guān)的基因在多殺性巴氏桿菌基因組上分布較為集中，均位于兩個(gè)保守的且與LPS合成無關(guān)的基因priA和fpg之間，不同的Heddleston血清型參考菌株包含有5～13個(gè)不等基因[14]。通過對(duì)其同源性分析，可將多殺性巴氏桿菌分為8個(gè)不同的基因型，LPS基因型L1包括血清型1和14，L2包括血清型2和5，L3包括血清型3和4，L4包括血清型6和7，L5包括血清型9，L6包括血清型10、11、12和15，L7包括血清型8和13，L8包括血清型16[5]。多殺性巴氏桿菌LPS外核編碼基因簇的差異，為多殺性巴氏桿菌基于LPS分型提供了理論基礎(chǔ)。Harper M等[5]根據(jù)不同Heddleston血清型外核側(cè)鏈多糖組裝所需的不同基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，建立了一種能對(duì)全部8種LPS基因型進(jìn)行鑒定的多重PCR方法，該方法與質(zhì)譜分析結(jié)果匹配良好，能夠?qū)θ?6種Heddleston血清型的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)，但不能與Heddleston分型方法形成一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。Peng等從患呼吸系統(tǒng)疾病的豬肺臟分離獲得115株多殺性巴氏桿菌，經(jīng)LPS多重PCR分型檢測(cè)包括2種基因型，其中L3 基因型占22.6%，L6基因型占77.4%[16]。

4 多位點(diǎn)序列分型方法

多殺性巴氏桿菌的多位點(diǎn)序列分型(MLST)是由多位點(diǎn)酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)衍生而來的，是以核酸序列為基礎(chǔ)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型的方法，它基于7個(gè)看家基因的等位基因位點(diǎn)的組合而獲得目標(biāo)菌株的序列型(sequence type，ST型)[6]。由于看家基因序列的變化速率很慢，若兩菌株的分型結(jié)果相同，便可以認(rèn)為這兩株細(xì)菌屬于相同克隆或克隆群。多殺性巴氏桿菌多位點(diǎn)序列分型在線數(shù)據(jù)庫有2個(gè)(http://pubmlst.org/pmultocida)：RIRDC MLST由澳大利亞動(dòng)物研究所開發(fā)，主要針對(duì)禽源多殺性巴氏桿菌[6]，所使用的7個(gè)看家基因?yàn)閍dk(腺苷酸環(huán)化酶)、est(酯酶基因)、pmi(6-磷酸-甘露糖異構(gòu)酶基因)、gdhA(谷氨酸脫氫酶)、zwf(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、mdh(蘋果酸脫氫酶)、pgi(磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)，目前共有344個(gè)ST型，但已停止對(duì)外服務(wù)；Multi-host MLST由英國格拉斯哥大學(xué)開發(fā)，針對(duì)不同宿主來源的多殺性巴氏桿菌，所使用的7個(gè)看家基因?yàn)閍dk、aroA(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成基因)、deoD(嘌呤核苷酸磷酸化酶)、gdhA、g6pd(即zwf)、mdh、pgi，PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物參見http://pubmlst.org/pmultocida，目前共有72個(gè)ST型。多位點(diǎn)序列分型具有以下特點(diǎn)：分型力好、可重復(fù)性好；已經(jīng)實(shí)現(xiàn)全球數(shù)據(jù)比對(duì)和綜合分析；分辨力一般，不能單獨(dú)用于暴發(fā)菌株溯源分析；成本比較高。已有研究表明，我國引起禽霍亂的禽源多殺性巴氏桿菌主要為ST129[14,16]。Petersen A等[17]和Moustafa A M等[18]分別對(duì)與出血性敗血癥相關(guān)的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行RIRDC MLST分析，發(fā)現(xiàn)與該病相關(guān)的菌株主要為ST122。García-Alvarez A等[19]對(duì)分離自不同商品化養(yǎng)兔場(chǎng)的11株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行multi-host MLST分型，發(fā)現(xiàn)全部為ST11。García-Alvarez 等對(duì)分離自綿羊肺炎的43株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行Multi-host MLST分型檢測(cè)，共檢測(cè)出16個(gè)ST型，其中ST50和ST19為主要的ST型，占全部菌株的53.5%，而且所有ST型只在患小反芻獸疫的羊中檢測(cè)出，說明這些ST型所屬菌株具有宿主特異性。研究還表明，綿羊分離株和豬分離株分屬于不同的亞群[20]。上述研究均說明多殺性巴氏桿菌的ST型與動(dòng)物疫病之間可能存在的一定的相關(guān)性。

5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)是基于細(xì)菌DNA指紋圖譜的基因分型技術(shù)，基本過程是將純培養(yǎng)的細(xì)菌與低熔點(diǎn)瓊脂糖(含SDS)進(jìn)行包埋，用蛋白酶K消化，待DNA釋放后，選用識(shí)別稀有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，獲得大小不等的DNA片段，在外加脈沖電場(chǎng)的低濃度瓊脂糖凝膠中分離，產(chǎn)生數(shù)量有限的DNA條帶，染膠、讀膠，用計(jì)算機(jī)軟件(如Bion Numeris)進(jìn)行分析。影響脈沖場(chǎng)凝膠電泳分辨力的因素包括限制性內(nèi)切酶的選擇、脈沖時(shí)間、電場(chǎng)強(qiáng)度、溫度、緩沖液組成、瓊脂糖類型和濃度、電場(chǎng)夾角等。PFGE分型力好、分辨力高、可重復(fù)性好，已有成熟的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)方案，可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的網(wǎng)絡(luò)化，對(duì)于大部分細(xì)菌是暴發(fā)溯源中細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Cardoso-Toset F等[21]對(duì)從不同患敗血癥豬的各種組織中分離的多殺性巴氏桿菌，利用Bsp1201限制性內(nèi)切酶進(jìn)行PFGE分型，證明為同一菌株感染。Moustafa A M等[18]對(duì)分離自巴基斯坦和泰國的23株多殺性巴氏桿菌進(jìn)行PFGE分型發(fā)現(xiàn)，兩國分離的菌株只有1條酶切條帶的差異，而且各國田間分離株與各自使用的疫苗株帶型相同。Dagleish M P等[22]對(duì)英國臨床分離的1株牛源多殺性巴氏桿菌與美國1株牛肺炎模型菌株進(jìn)行比較分析，PFGE分別有10條和11條帶，說明兩者之間具有地域和遺傳學(xué)上的差異，而且氣管內(nèi)接種兩者引起的病理嚴(yán)重程度不同，這也對(duì)新型疫苗的研發(fā)提供了依據(jù)。

6 全基因組測(cè)序

全基因組測(cè)序(WGS)是指通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)病原菌整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，并通過生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)序列特征進(jìn)行分析，可在全基因組水平探究物種的遺傳進(jìn)化規(guī)律和種群遷移等。目前，全基因組測(cè)序分型主要有兩種方式，即基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性分型(whole genome-based single-nucleotide polymorphisms,wgSNP)和基于全基因組的多位點(diǎn)序列分型(whole genome multilocus sequence typing,wgMLST)。wgSNP是在全基因組序列的水平上選擇一定數(shù)目的SNP，比較不同細(xì)菌基因組SNP的信息，從而達(dá)到將同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株進(jìn)行分型的目的。wgMLST是使用某一個(gè)種的細(xì)菌核心基因組中的成百上千個(gè)基因位點(diǎn)的序列差異對(duì)菌株進(jìn)行區(qū)分和分型的方法。Moustafa A M等[8]對(duì)12株引起敗血性出血癥的多殺性巴氏桿菌和1株疫苗株的全基因組序列測(cè)序后，基于wgSNP構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)分離自不同國家的菌株聚類在不同的分支；比對(duì)1 824個(gè)核心基因后發(fā)現(xiàn)，96個(gè)基因?yàn)?3個(gè)菌株所共有，全基因組測(cè)序一方面能對(duì)上述菌株進(jìn)行區(qū)分，另一方面也能提供候選基因用來建立快速診斷技術(shù)。全基因組測(cè)序方法在多殺性巴氏桿菌分型中由于在全基因組水平基于序列多態(tài)性進(jìn)行分型，因此理論上比傳統(tǒng)的分子分型方法具有更高的分辨力，具有良好的分型力、可重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室間可比性，便以建立分析網(wǎng)站和公共數(shù)據(jù)庫，容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和網(wǎng)絡(luò)化應(yīng)用，具有取代目前所有分子分型方法的潛力。

7 小結(jié)和展望

多殺性巴氏桿菌的血清分型或基因分型是其流行病學(xué)調(diào)查常采用的方法，選擇適宜的分型方法，對(duì)于了解其感染和致病規(guī)律等具有十分重要的意義。理想的病原菌分型方法應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：一是分型力好，能獲得菌株分型結(jié)果；二是分辨力高，能夠區(qū)分不相關(guān)的菌株；三是可重復(fù)性好，對(duì)同一菌株反復(fù)測(cè)試能夠獲得相同的結(jié)果；四是可比性好，不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可以放在一起分析?；谝陨蠋c(diǎn)，采用標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌分子分型監(jiān)測(cè)技術(shù)，構(gòu)建細(xì)菌性傳染病分子分型實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)特征型別簇，提出預(yù)警信息，通過流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性傳染病暴發(fā)流行，尤其是發(fā)現(xiàn)傳染病跨地區(qū)傳播和散在分布于不同地理區(qū)域的暴發(fā)流行，有助于實(shí)現(xiàn)細(xì)菌病監(jiān)控、跨地區(qū)關(guān)聯(lián)分析和傳染病的溯源。尤其是隨著測(cè)序技術(shù)的成熟，全基因組測(cè)序所需時(shí)間和成本不斷降低，為在全基因組序列水平上進(jìn)行流行病學(xué)分析提供了基礎(chǔ)。WGS分型因其全面反應(yīng)了病原菌的遺傳和變異特征，提高了菌株進(jìn)化和溯源分析的分辨力，有助于快速確認(rèn)并追蹤病原體、描述菌群結(jié)構(gòu)、評(píng)估某種致病菌群的出現(xiàn)和傳播機(jī)制，其結(jié)果不但可以直接與經(jīng)典微生物分型方法，如MLST和PFGE進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)還可以通過公共數(shù)據(jù)庫方便全球共享和分析，在疾病監(jiān)控和暴發(fā)調(diào)查中將發(fā)揮越來越大的優(yōu)勢(shì)作用。