曹永強(qiáng)， 余志堅(jiān)， 陳 超， 張 健， 楊貞耐,*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048； 2.東君乳業(yè)(禹城)有限公司， 山東 德州 253000)

乳糖酶又稱β-半乳糖苷酶或β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。乳糖酶可水解乳糖生成人體易于消化吸收的單糖即α-D-葡萄糖和β-D-半乳糖，還可促進(jìn)半乳糖與乳糖連接生成低聚半乳糖，在乳品工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。

當(dāng)前，微生物來源的乳糖酶應(yīng)用廣泛，具有酶源豐富、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、周期短等特點(diǎn)，備受生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注。食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JACFA)和美國食品藥品管理局(FDA)認(rèn)定乳糖酶為安全酶，我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB2760 中也將乳糖酶列為其中[2]。

乳糖酶一般存在于植物、哺乳動(dòng)物的腸道中，某些微生物也會(huì)產(chǎn)乳糖酶。當(dāng)前，只有微生物來源的乳糖酶具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[3-4]。工業(yè)生產(chǎn)中常用產(chǎn)乳糖酶菌種來源主要有酵母、霉菌和嗜熱菌[5]。嗜熱菌產(chǎn)乳糖酶方式為胞外分泌表達(dá)，在 95～110 ℃時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性[6]，其最適酶活性溫度為 105 ℃，主要用于縮短工藝流程時(shí)間，減少工藝步驟。嗜熱鏈球菌是一種原核微生物，鏈球菌屬[7]，它常與保加利亞乳桿菌共同用于酸奶生產(chǎn)，二者之間由于存在共生作用，可以大大減少工業(yè)流程所需時(shí)間[8]。研究食源性嗜熱鏈球菌產(chǎn)乳糖酶，一方面可以保證乳糖酶的安全性，另一方面，可提高菌株的工業(yè)使用價(jià)值。

不同來源的微生物 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)有很大差異，其生產(chǎn)和純化工藝是影響酶廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵步驟[9]。因此，研究可批量工業(yè)化應(yīng)用的產(chǎn)乳糖酶微生物、乳糖酶高產(chǎn)菌和低成本的純化方法具有重要意義。對乳糖酶酶學(xué)特性的研究，也可為乳糖酶生產(chǎn)應(yīng)用提供切實(shí)可行的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

嗜熱鏈球菌GST-6菌株(st.GST-6)，現(xiàn)保存于本課題組實(shí)驗(yàn)室；鄰硝基苯-β-D 半乳糖苷(2-NitropHenyl-beta-D-galactopyranoside-ONPG)、鄰硝基苯酚(2-NitropHenol-ONP)、碳酸鈉、氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、兩水合磷酸二氫鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；M17液體培養(yǎng)基(1 L)有大豆蛋白胨(3.3 g)、酪蛋白胨(3.3 g)、魚蛋白胨(3.3 g)、酵母浸粉(2.5 g)、牛肉膏(5 g)、吐溫80(500 μL)、葡萄糖(5 g)、乳糖(5 g)、七水硫酸鎂(0.2 g)、抗壞血酸鈉(1.5 g)、β-甘油磷酸二鈉(12 g)；磷酸鹽緩沖液的配方，參考GB/T 8276—1999。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CR21GⅢ型立式高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；U3900型紫外分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；S20數(shù)顯pH計(jì)，梅特利-托利多儀器有限公司；THZ-D型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒儀器科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1粗酶液制備

菌種活化接種M17培養(yǎng)基中，42 ℃恒溫培養(yǎng)8 h。取5 mL發(fā)酵液，在4 ℃以10 000 r/min離心10 min，收集菌體。用1 mL磷酸鹽緩沖液沖洗2次，再加入4 mL磷酸鹽緩沖液，懸浮后加入0.5 mL已經(jīng)預(yù)熱到37 ℃的溶菌酶(10 mg/mL)，渦旋混勻后，37 ℃水浴保持10 min，加入0.5 mL的氯化鈉溶液(4 mol/L)，靜置50 min[10]。

1.3.2乳糖酶活力的測定

1.3.2.1 ONP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

6支100 mL容量瓶中分別加入0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mL的ONP(0.01 mol/L)溶液，去離子水定容至100 mL，分別加入25 mL的碳酸鈉溶液，混勻后用磷酸鹽緩沖液定容。紫外分光光度計(jì)測定每組在420 nm處的吸光值。以O(shè)NP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 酶活力測定方法

取1 mL酶液，37 ℃水浴5 min，快速加入5 mL預(yù)熱到37 ℃的ONPG溶液，晃動(dòng)混勻，37 ℃反應(yīng)10 min，后加入2 mL的碳酸鈉終止反應(yīng)，冷卻后于420 nm下測定吸光值[11]?？瞻捉M：在添加ONPG前先加入2 mL碳酸鈉溶液。

1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)測定影響乳糖酶產(chǎn)量因素

對影響嗜熱鏈球菌產(chǎn)乳糖酶的9個(gè)因素(包括培養(yǎng)基的碳源及其濃度、氮源及其濃度、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值、金屬離子)分別進(jìn)行研究。以產(chǎn)乳糖酶活力為指標(biāo)，以M17培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將M17培養(yǎng)基中的碳源(葡萄糖)分別以等量的葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖替換；選取乳糖質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25 g/L；將M17培養(yǎng)基中的氮源(大豆蛋白胨)分別以等量的大豆蛋白胨、魚蛋白胨和酪蛋白胨替換；選取大豆蛋白胨質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25 g/L；選取接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%(其他發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時(shí)間8 h、pH值為7)；選取發(fā)酵溫度分別為37、39、42、45、55 ℃(其他發(fā)酵條件為接種量1%、發(fā)酵時(shí)間8 h、pH值為7)；選取發(fā)酵時(shí)間分別為6、8、10、12、16 h(其他發(fā)酵條件為接種量1%、發(fā)酵溫度42 ℃、pH值為7)；選取培養(yǎng)基初始pH值分別為3、4、5、6、7、8(其他發(fā)酵條件為接種量1%、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時(shí)間8 h)；將M17培養(yǎng)基中的金屬離子(七水硫酸鎂)分別以等量的磷酸二氫鉀、一水合硫酸錳、氯化鈣和七水合硫酸亞鐵替換。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，以培養(yǎng)基初始pH值、接種量、乳糖濃度為自變量，以乳糖酶活力為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析原理(Box-Behnken, BBD)，通過Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，研究st.GST-6產(chǎn)乳糖酶的最佳發(fā)酵條件[12]。

1.3.5乳糖酶的制備及提純

1.3.5.1 硫酸銨分級沉淀

粗酶液經(jīng)超聲破碎，在4 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液平分成9份，量其體積，計(jì)算硫酸銨在10%～90%飽和度下的質(zhì)量。稱取不同質(zhì)量的硫酸銨，渦旋攪拌緩慢加入，攪拌20 min后于4 ℃靜置4 h。沉淀后，在4 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液測定酶活力，空白組只添加磷酸鹽緩沖液。

1.3.5.2 硫酸銨沉淀

由分級沉淀可得純化乳糖酶的最佳硫酸銨飽和度范圍。先取粗酶液量其體積，計(jì)算并稱取該體積范圍內(nèi)上限和下限飽和度對應(yīng)的硫酸銨質(zhì)量。緩慢加入范圍下限質(zhì)量的硫酸銨于酶液中，攪拌20 min后于4 ℃靜置2 h。在4 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液，緩慢加入范圍上限質(zhì)量的硫酸銨，攪拌20 min后于4 ℃靜置2 h。在4 ℃以10 000 r/min離心10 min，棄上清，用20 mL磷酸鹽緩沖溶液溶解沉淀，于4 ℃保存[13-14]。

1.3.5.3 DEAE-SepHarose Fast Flow離子交換柱

冷凍干燥后的酶粉末，配制成0.5 mg/mL的溶液。使用DEAE-SepHarose Fast Flow離子交換柱(2.6 cm×30 cm)對粗酶液進(jìn)行純化，上樣量為10 mL，流速為1.5 mL/min，溶劑為pH值為7的磷酸鹽緩沖液。先用緩沖液洗脫50 min，然后用分別含有0.1、0.5、0.9 mol的NaCl的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫。收集峰值附近的洗脫液，透析后冷凍干燥[5]。

1.3.5.4 SepHadex G75純化乳糖酶

將1.3.5.3中得到的酶粉末配制成0.5 mg/mL的溶液，經(jīng)SepHadex G75柱子(2.6 cm×60 cm)對酶液進(jìn)行純化。上樣量為10 mL，流速為1.5 mL/min，溶劑為0.09 mol/L的磷酸鹽緩沖液，收集峰值附近的蛋白冷凍干燥[15]。

1.3.6酶學(xué)特性研究

1.3.6.1 溫度對乳糖酶活性及穩(wěn)定性的影響[16]

取5支試管，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的純酶液1 mL，45 ℃保溫10 min，30、40、50、60、70 ℃預(yù)熱10 min后，測定相對酶活。

取5支試管，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的純酶液1 mL，分別在25、35、45、55、65 ℃下保溫，2 h后測定相對酶活。

1.3.6.2 pH值對乳糖酶活性及穩(wěn)定性的影響

取5支試管分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的純酶液1 mL，用pH值分別為3、4、5、6、7、8的磷酸鹽緩沖液配制ONPG溶液，測定相對酶活。

1.3.6.3 金屬離子對酶活性的影響

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的純酶液1 mL，分別加入濃度為1、5、10 mmol/L的硫酸錳、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鋅和硫酸亞鐵溶液中，室溫保存30 min，測定酶活。

1.3.6.4 抑制劑對酶活性的影響

1.3.6.5 底物濃度對酶活性的影響

分別配制濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mmol/L ONPG 溶液，取1 mL酶液，測定相對酶活。

1.4 實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用三平行實(shí)驗(yàn)取平均值，通過SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件處理方差，當(dāng)p<0.05時(shí)差異顯著，當(dāng)p>0.05時(shí)，差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線

ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，其中y=0.018x-0.0836，R2=0.006 2。

圖1 ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of ONP

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)測定影響乳糖酶產(chǎn)量因素

2.2.1不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

不同碳源時(shí)菌株產(chǎn)乳糖酶的活性如圖2。從圖2可以看出，5種不同碳源的培養(yǎng)基中st.GST-6產(chǎn)乳糖酶活性存在顯著性差異。其中乳糖對菌株產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大，其活性為88.9 U/mL。原始配方中乳糖和葡萄糖共同為碳源的作用次之，故乳糖參與時(shí)會(huì)促進(jìn)菌株產(chǎn)酶。

圖2 碳源種類對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of carbon sources on lactase production

2.2.2不同乳糖濃度對菌株產(chǎn)酶的影響

選取菌株產(chǎn)乳糖酶的重要碳源即乳糖作為研究對象，不同乳糖濃度時(shí)菌株產(chǎn)乳糖酶的總活性如圖3。從圖3中可以看出，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度為15 g/mL時(shí)，對菌株產(chǎn)乳糖酶的促進(jìn)作用最大，酶活性為95.76 U/mL。高于或者低于這個(gè)濃度區(qū)間，對菌株產(chǎn)酶的促進(jìn)作用會(huì)降低，故乳糖質(zhì)量濃度為15 g/mL時(shí)為最適乳糖濃度。不同濃度時(shí)菌株產(chǎn)乳糖酶差異大，故乳糖濃度為影響產(chǎn)酶的主要因素。

圖3 乳糖質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of lactose concentration on lactase production

2.2.3不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

So L3=950×I5+475+475-200=950×I5+750,L4=A2-200-200-(950×I5+750)=A2-950×I5-1 150

不同氮源時(shí)菌株產(chǎn)酶的總活性如圖4。從圖4可以看出，不同的蛋白對菌株產(chǎn)酶的影響存在顯著差異，其中大豆蛋白胨對菌株產(chǎn)酶的促進(jìn)作用較強(qiáng)。在大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株產(chǎn)乳糖酶活性為71.3 U/mL，較原始配方中3種蛋白組合時(shí)，st.GST-6產(chǎn)乳糖酶的量有所提高。

圖4 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on lactase production

2.2.4不同大豆蛋白胨濃度對菌株產(chǎn)酶的影響

氮源濃度可影響菌株產(chǎn)酶量，不同大豆蛋白胨濃度時(shí)菌株產(chǎn)酶的總活性如圖5。從圖5中可以看出，隨著大豆蛋白胨濃度增高，菌株產(chǎn)乳糖酶的活性呈現(xiàn)先增后降低的趨勢，當(dāng)大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，酶活性達(dá)到最高值，為84.2 U/mL。

圖5 大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of soy peptone concentrations on lactase production

2.2.5不同金屬離子對菌株產(chǎn)酶的影響

不同金屬離子對菌株產(chǎn)酶總活性的影響如圖6。從圖6中可以看出，不同金屬離子對菌株產(chǎn)酶的影響存在顯著性差異。鈣離子可顯著促進(jìn)st.GST-6產(chǎn)乳糖酶，乳糖酶活性為42.9 U/mL。七水和硫酸亞鐵對菌株產(chǎn)乳糖酶的作用次之，選擇鈣離子為最佳金屬離子。

圖6 金屬離子對菌株產(chǎn)乳糖酶的影響Fig.6 Effects of various metal ions concentrations on lactase production

2.2.6溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

不同溫度時(shí)菌株產(chǎn)酶的總活性如圖7。從圖7可以看出，不同溫度對菌株產(chǎn)酶存在顯著性差異，發(fā)酵溫度為39 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)乳糖酶活性高于其他溫度，此時(shí)酶的最大活力達(dá)到70.8 U/mL。而隨著溫度的升高，菌株產(chǎn)酶的總活性下降，當(dāng)溫度升高到55 ℃時(shí)，其他條件相同情況下，菌株產(chǎn)的乳糖酶活性僅為26.9 U/mL。

圖7 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of temperatures on lactase production

2.2.7培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶總活性的影響如圖8。從圖8中可以看出，不同培養(yǎng)基初始值pH的酶活性存在顯著差異。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在6～7時(shí)，酶活性最高，在培養(yǎng)基初始pH值為7時(shí)，達(dá)到67.9 U/mL；培養(yǎng)基初始pH值在4附近時(shí)，菌株產(chǎn)乳糖酶受到抑制；培養(yǎng)基初始pH值高于7時(shí)，菌株產(chǎn)酶活性隨培養(yǎng)基初始pH值的升高而降低。不同pH值時(shí)菌株產(chǎn)乳糖酶差異大，故培養(yǎng)基初始pH值為影響產(chǎn)酶的主要因素。

圖8 培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of initial pH values on lactase production

2.2.8不同發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響

圖9 發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of fermentation time on lactase production

不同發(fā)酵時(shí)間菌株產(chǎn)酶的總活性如圖9。從圖9可以看出，當(dāng)培養(yǎng)到6 h時(shí)，發(fā)酵液已經(jīng)產(chǎn)生大量酶，發(fā)酵8 h時(shí)，酶活力達(dá)到最高值，為75.3 U/mL。繼續(xù)培養(yǎng)更長時(shí)間時(shí)，酶活性降低。故較適發(fā)酵時(shí)間為8 h。

2.2.9不同接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

不同接種量時(shí)菌株產(chǎn)酶的總活性如圖10。從圖10可以看出，接種量對產(chǎn)總酶活性的影響存在顯著性差異，當(dāng)接種量為2%時(shí)，酶的活性最高，為79.1 U/mL；當(dāng)接種量高于2%時(shí)，酶活會(huì)隨接種量增高而降低；接種量低于2%時(shí)，酶活性降低。不同接種量時(shí)菌株產(chǎn)乳糖酶差異大，故接種量為影響產(chǎn)酶的主要因素。

圖10 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effects of inoculation on lactase production

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

2.3.1模型與顯著性分析

通過對單因素實(shí)驗(yàn)分析可知，影響st.GST-6產(chǎn)乳糖酶最主要的因素為：pH值、接種量、乳糖濃度。以培養(yǎng)基初始pH值、接種量、乳糖濃度為自變量，以乳糖酶總活性為響應(yīng)值，通過Design-Expert響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)17組實(shí)驗(yàn)，如表1。通過分析，其對應(yīng)關(guān)系見式(1)。

Y=81.95+10.15×A+18.93×B-5.29×C-
7.97×A×B-10.12×A×C+14.86×B×C+
2.30×A2-17.73×B2+2.60×C2。

(1)

2.3.2響應(yīng)面圖分析

圖11、圖12、圖13為通過Design-Expert軟件得到的響應(yīng)面圖。圖11表示當(dāng)接種量固定為0，乳糖濃度和培養(yǎng)基初始pH值對酶活影響。由圖11可以看出隨著乳糖濃度和pH值的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，培養(yǎng)基初始pH值和乳糖濃度之間存在交互作用。圖12表示當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值固定為0，乳糖濃度和接種量對酶活的影響，隨著乳糖濃度和接種量的增加，酶活呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢。圖13表示當(dāng)乳糖濃度固定為0時(shí)，培養(yǎng)基初始pH值和接種量對酶活的影響，隨著培養(yǎng)基初始pH值和接種量的增加，酶活先增加后減小。由圖11～圖13的立體模型可以看出，乳糖酶活Y存在最大值，最大值表示乳糖濃度、pH值、接種量影響乳糖酶活的最佳配比。通過Design-Expert軟件擬合計(jì)算出最適條件為乳糖質(zhì)量濃度為25.00 g/L，培養(yǎng)基初始pH值為6.78，接種量為1%時(shí)，菌株產(chǎn)酶活性最大，為112.63 U/mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在此優(yōu)選條件下，總酶活為109.3 U/mL。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果

表2 回歸方程的方差分析ANAOV

圖11 培養(yǎng)基初始pH值和乳糖濃度對乳糖酶活性影響響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface and contour plots for effects of initial pH values and lactose concentrations on lactase production

圖12 接種量和乳糖濃度對乳糖酶活性影響響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface and contour plots for effects of inoculation and lactose concentrations on lactase production

圖13 培養(yǎng)基初始pH值和接種量對乳糖酶活性影響響應(yīng)面圖Fig.13 Response surface and contour plots for effects of initialpH values and inoculation on lactase production

2.4 乳糖酶的分離及提純

2.4.1硫酸銨分級沉淀

不同飽和度的硫酸銨對乳糖酶沉淀的影響如圖14。從圖14可以看出，當(dāng)硫酸銨飽和度小于40%時(shí)，酶活性隨飽和度下降的趨勢顯著，此時(shí)粗酶液只有少許沉淀；當(dāng)硫酸鈉飽和度在40%～50%時(shí)，酶活性急速下降，表明此時(shí)的乳糖酶均與硫酸銨結(jié)合而沉淀；當(dāng)飽和度大于50%時(shí)，酶活變化變緩，表明大量乳糖酶被結(jié)合沉淀下來。綜上，硫酸銨純化乳糖酶的飽和度范圍為10%～50%。

圖14 硫酸銨沉淀上清液中乳糖酶酶活力變化曲線Fig.14 Enzyme activity in supernatant after various (NH4)2SO4 saturation precipitation

2.4.2DEAE-SepHarose Fast Flow純化結(jié)果

使用DEAE-SepHarose Fast Flow離子交換柱純化乳糖酶的結(jié)果如圖15，純化過程出現(xiàn)4個(gè)峰。收集每個(gè)峰檢測酶活性發(fā)現(xiàn)峰3具有乳糖酶活性，而其他峰的酶活性顯著低于峰3，收集峰3進(jìn)行透析冷凍干燥。

圖15 DEAE-SepHarose Fast Flow離子交換柱洗脫峰Fig.15 Chromatogram of lactase by DEAE-SepHarose Fast Flow

2.4.3SepHadex G75純化結(jié)果分析

使用SepHadex G75層析柱純化乳糖酶的結(jié)果如圖16，純化過程出現(xiàn)1個(gè)峰。收集峰附近洗脫液可檢測酶活性，透析冷凍干燥后得到較純的乳糖酶。

圖16 SepHadex G75柱洗脫峰Fig.16 Chromatogram of lactase by SepHadex G75

2.4.4不同溫度對乳糖酶活性的影響

不同溫度對乳糖酶的活性有很大影響(見圖17)。由圖17(a)可以看出，酶活性隨溫度上升而增高，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，酶具有最大活力，表明st.GST-6產(chǎn)乳糖酶在高溫下仍具有很高的活力。乳糖酶在不同溫度的熱穩(wěn)定性如圖17(b)，酶的熱穩(wěn)定性隨溫度升高而降低，其中在30～40 ℃時(shí)酶的活性最大，保留了70%的活性，在50～60 ℃酶熱穩(wěn)定性下降趨勢加快。故st.GST-6產(chǎn)乳糖酶具有耐高溫的能力，但是持續(xù)時(shí)間較短，在應(yīng)用過程中需要注意保溫時(shí)間。

圖17 溫度對乳糖酶活性的影響Fig.17 Effects of temperatures on enzyme activity

2.4.5pH值對乳糖酶活性的影響

pH值對乳糖酶活性的影響如圖18。pH值為3～4時(shí)，酶的活性較低；在5～6時(shí)，酶的活性很高，并保留了80%以上的活性；當(dāng)pH值高于6時(shí)，酶的活性又逐漸降低。說明pH值過高或者過低都會(huì)降低酶的活性，st.GST-6產(chǎn)乳糖酶的最適pH值為6。

圖18 pH值對乳糖酶活性的影響Fig.18 Effects of pH values on enzyme activity

2.4.6不同濃度金屬離子對乳糖酶活性的影響

金屬離子對酶活性的影響主要為激活作用和抑制作用,不同濃度金屬離子對乳糖酶活性影響如圖19。錳離子、鎂離子和亞鐵離子均對酶起到激活作用，并且隨濃度升高，激活作用也增強(qiáng)；鈣離子、銅離子、鋅離子對酶起到抑制作用，并且基本上隨濃度升高，抑制作用減弱。其中，錳離子的激活作用最強(qiáng)，銅離子的抑制作用最強(qiáng)。

圖19 金屬離子濃度對乳糖酶活性的影響Fig.19 Effects of various metal ions on enzyme activity

圖20 抑制劑對乳糖酶活性的影響Fig.20 Effects of inhibitors on enzyme activity

2.4.7不同抑制劑對乳糖酶活性的影響

不同抑制劑對乳糖酶活性影響如圖20。EDTA對酶活性幾乎沒有抑制作用，α乳糖對乳糖酶有一定的抑制作用，而SDS對乳糖酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用。

2.4.8乳糖酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

底物濃度的倒數(shù)與酶活的倒數(shù)關(guān)系如圖21。利用雙倒數(shù)法求米氏常數(shù)，直線在X軸的截距為-1/K，在Y軸的截距為1/Vmax，由方程可得，最大速度Vmax=2.20 μmol/min，Km=0.27 mmol/L。

圖21 底物濃度倒數(shù)與酶活性倒數(shù)關(guān)系Fig.21 Lineweaver-Burk plot of lactase using ONPG as substrate

3 結(jié) 論

培養(yǎng)基中提供微生物生長所需的營養(yǎng)要素對其產(chǎn)酶具有重要影響。碳源能提供微生物生長所需的能量，同時(shí)某些碳源還是酶的誘導(dǎo)物，碳源種類會(huì)影響乳糖酶的產(chǎn)量[17]。st.GST-6產(chǎn)乳糖酶的最適碳源為乳糖，這可能因?yàn)槿樘敲甘且环N胞內(nèi)酶，它的合成需要誘導(dǎo)物質(zhì)來完成。乳糖濃度的高低影響到乳糖酶的產(chǎn)量，乳糖濃度超過最適濃度時(shí)，由于打破了適合微生物生長的C/N，菌株生長緩慢，乳糖酶的產(chǎn)生受到抑制，導(dǎo)致酶產(chǎn)量下降[18-19]。氮源作為構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料，大豆蛋白胨的添加量會(huì)影響乳糖酶的產(chǎn)量，這可能是大豆蛋白胨容易被st.GST-6利用導(dǎo)致的。金屬離子種類能影響乳糖酶的產(chǎn)量，鈣離子可促進(jìn)菌株產(chǎn)酶，與鈣離子對乳糖酶合成途徑相關(guān)酶的激活作用有關(guān)[20]。發(fā)酵溫度會(huì)影響酶促反應(yīng)的速率，在最佳溫度下，菌株產(chǎn)酶的反應(yīng)處于最佳條件，當(dāng)溫度更高時(shí)，酶失去活性發(fā)生不可逆反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)乳糖酶活性降低[21]。培養(yǎng)基初始pH值在產(chǎn)酶過程中會(huì)不斷變化[22]，本研究對培養(yǎng)基初始pH值的研究表明其對菌株產(chǎn)酶也有較大影響。

利用硫酸銨分級沉淀，當(dāng)其飽和度為10%時(shí)可除去粗酶液中的雜蛋白，進(jìn)一步提高飽和度至50%時(shí)沉淀乳糖酶，可以獲得更純的酶。st.GST-6乳糖酶可耐受70 ℃溫度，在高溫下也能保證其活性，工業(yè)生產(chǎn)中可以在殺菌過程中添加，既保證了生產(chǎn)效率，又起到了分解乳糖的作用。隨著pH值的升高，乳糖酶活力逐漸降低，這是因?yàn)檫^酸或過堿會(huì)影響酶活性中心結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)的解離狀態(tài)，使得底物不能和酶結(jié)合[23]。SDS 對乳糖酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，這是因?yàn)槟承┮种苿┑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，與底物競爭酶的活性中心并與之結(jié)合，從而減少了酶與底物結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶的反應(yīng)速度降低。對乳糖酶酶學(xué)特性的研究，可以為實(shí)際生產(chǎn)中更有效地利用乳糖酶提供切實(shí)可行的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張敏文, 顧取良, 張博,等. 乳糖酶研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志, 2011, 31(3):81-86.

ZHANG Minwen, GU Quliang, ZHANG Bo, et al. Advancement in lactase study[J]. Journal of Microbiology, 2011, 31(3):81-86.

[2] 李紅, 趙春燕. 乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌的篩選初報(bào)[J]. 中國釀造, 2006, 25(3):51-53.

LI Hong, ZHAO Chunyan. A primary report on the screening of nisin-producing strain [J]. China Brewing, 2006, 25(3):51-53.

[3] WAN V S, TOMAR S K, ALI B, et al. Production of β-galactosidase fromStreptococcusthermophilus, for galactooligosaccharides synthesis[J]. Journal of Food Science and Technology, 2015, 52(7):4206-4215.

[4] 王建芳, 陳芳, 靳亞平. 嗜熱鏈球菌適宜培養(yǎng)條件研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(2):56-58.

WANG Jianfang, CHEN Fang, JIN Yanping. Research on appropriate culture condition ofS.thermophilus[J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2008, 17(2):56-58.

[5] GEZGIN Y, TANYOLAC B, ELTEM R. Some characteristics and isolation of novel thermostable β-galactosidase fromThermusoshimai, DSM 12092[J]. Food Science & Biotechnology, 2013, 22(1):63-70.

[6] 管聲, 梁琪, 宋雪梅,等. 牦牛乳乳糖酶解及其預(yù)熱處理?xiàng)l件優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2017, 43(1):118-123.

GUAN Sheng, LIANG Qi, SONG Xuemei, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of yak milk lactose and preheat treatment process[J].Food and Fermentation Industries, 2017, 43(1):118-123.

[7] 陳衛(wèi), 張灝, 丁霄霖. 一種高溫乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及對牛乳中乳糖的水解[J].中國乳品工業(yè), 2002, 30(6):15-18.

CHEN Wei, ZHANG Hao, DING Xiaolin. Study on properties of thermostable β-galactosidase and hydrolysis of lactose in milk [J]. China Dairy Industry, 2002, 30(6):15-18.

[8] 官雪芳, 鄭怡, 徐慶賢,等. 一株酸奶發(fā)酵嗜熱鏈球菌的選育研究[C]. 北京：中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)，2016：97.

[9] 李文婷, 邊斐, 王翠萍,等. 凝結(jié)芽孢桿菌RY237 β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(14)：111-115.

LI Wenting, BIAN Fei, WANG Cuiping, et al. Characterization of β-galactosidase fromBacilluscoagulansRY237[J]. Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(14):111-115.

[10] 趙春萍. 高產(chǎn)乳糖酶酵母菌篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化及酶的分離提純[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[11] 侯重文, 朱梓昂, 張秀華,等. 畢赤酵母工程菌產(chǎn)乳糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化的研究[J]. 食品與藥品, 2016, 18(5):305-311.

HOU Chongwen, ZHU Ziang, ZHANG Xiuhua, et al. Optimization of fermentation conditions of lactase-producing pichiapastoris [J]. Food and Drug, 2016, 18(5):305-311.

[12] 崔慶新, 劉軍海, 黃寶旭,等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化黨參多糖提取工藝[J]. 藥物分析雜志, 2011, 31(5):816-820.

CUI Qingxin, LIU Junhai, HUANG Baoxu, et al. A primary report on the screening of nisin-producing strain [J]. China Brewing, 2011, 31(5):816-820.

[13] HUSAIN Q. Beta galactosidases and their potential applications: a review [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2010, 30(1):41.

[14] 朱運(yùn)平, 許麗亞, 范光森,等. 具有轉(zhuǎn)糖苷活性β-半乳糖苷酶菌株的篩選鑒定[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2017, 36(6):598-603.

ZHU Yunping, XU Liya, FAN Guangsen, et al. Screening and identification of β-galactosidase-producing microorganism with transgalactosylation activity [J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2017, 36(6):598-603.

[15] WANG K, LI G, YU S Q, et al. A novel metagenome-derived β-galactosidase: gene cloning, overexpression, purification and characterization[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2010, 88(1):155.

[16] 賈超. 米曲霉β-半乳糖苷酶的基因克隆與酶學(xué)特征分析[D]. 天津：天津科技大學(xué), 2016.

[17] 董自星, 賈超, 王君, 等. 米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表達(dá)與酶學(xué)特性分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(21)：172-177.

DONG Zixing, JIA Chao, WANG Jun, et al. Cloning, expression and biochemical characterization of β-galactosidases fromAspergillusoryzae[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(21):172-177.

[18] 付志軍, 史玉東, 康小紅,等. 乳糖酶在生產(chǎn)低乳糖奶中的應(yīng)用研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 24(8):48-52.

FU Zhijun, SHI Yudong, KANG Xiaohong, et al.Study on lactases in the production of low-lactose milk application[J].Food and Research and Development, 2008, 24(8):48-52.

[19] 黃新仁. 響應(yīng)面法在生物過程優(yōu)化中的應(yīng)用[D]. 長沙：湖南大學(xué), 2011.

[20] 何熹, 王彥寧, 李超,等. 乳酸菌與乳糖酶[J]. 食品研究與開發(fā), 2016, 37(16):202-205.

HE Xi, WANG Yanning, LI Chao, et al.Lactobacillusand lactase[J]. Food Research and Development, 2016, 37(16):202-205.

[21] 姚躍飛, 曾柏全. 現(xiàn)代固態(tài)發(fā)酵技術(shù)在食品加工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 食品與機(jī)械, 2005, 21(6):89-92.

YAO Yuefei, ZENG Baiquan. Application of modern solid-state fermentation technology in food processing [J]. Food and Machinery, 2005, 21(6):89-92.

[22] 山琳. 米曲霉乳糖酶的發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[23] 張莉, 李慶章, 田雷. β-半乳糖苷酶研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 40(7):128-131.

ZHANG Li, LI Qingzhang, TIAN Lei.Research advancement of β-galactosidase [J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2009, 40(7):128-131.