操麗麗, 周 俊, 鄭 峰, 姚江奇, 王 濤, 姜紹通, 龐 敏,*

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室， 安徽 合肥 230009； 2.安徽黃山云樂靈芝有限公司， 安徽 宣城 242609)

靈芝(Ganodermalucidum)是我國一種重要的藥用真菌，具有很高的藥用價值，素有“仙草、瑞草”之美譽，作為民間藥方延年益壽和滋補身體已經(jīng)有上千年歷史。靈芝含有多糖、核苷、三萜化合物、生物堿、不飽和脂肪酸、甾醇、有機鍺等活性成分[1-2]。靈芝多糖是靈芝中主要的生物活性成分，具有抗腫瘤[3-4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗氧化[6]等多種藥理活性，因此靈芝多糖是靈芝研究的一個熱點。

靈芝子實體多糖屬于胞內(nèi)多糖，存在于細胞壁或細胞間質(zhì)中，而靈芝子實體的細胞壁是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的致密結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致靈芝多糖不易從細胞內(nèi)提取出來。利用多糖易溶于熱水、稀酸、稀堿等極性溶液的特性，目前提取靈芝多糖的方法主要有熱水浸提法[7]、超聲協(xié)助水提法[8]、微波提取法[9]、酶法[10]、微波輔助超聲提取法[11]等。熱水浸提法提取多糖是工業(yè)生產(chǎn)常用的方法，但提取時間長、能耗大、得率低、活性差，限制了靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。超聲協(xié)助水提法以超聲波的高頻振蕩及其產(chǎn)生的“空穴效應(yīng)”破壞細胞結(jié)構(gòu)，有利于多糖從細胞內(nèi)溶出；酶法提取是以酶來降解細胞壁，使得胞內(nèi)多糖溶出，可提高靈芝多糖的得率；微波提取法是通過微波破壞細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)，從而使胞內(nèi)多糖快速溶出[12]，但這些方法因成本高，在工業(yè)上難以大規(guī)模的應(yīng)用。高壓熱水法是利用高壓對細胞的破碎作用，有利于熱水從胞內(nèi)溶出多糖，此提法方法簡單可行、適用性強，可用于大批量的工業(yè)生產(chǎn)[13]。

由于高溫高壓的提取強度會對多糖的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響，且抗氧化性是靈芝多糖的主要藥理活性之一，因此，本文通過正交試驗對高壓熱水提取靈芝多糖的工藝進行了優(yōu)化，并分析提取工藝對其抗氧化活性的影響，期望獲得的結(jié)果能為靈芝的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實體超微粉由安徽黃山云樂靈芝有限公司提供。

葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、無水乙醇、正丁醇、氯仿等試劑均為分析純，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機，日本日立公司；CR22GⅡ型超濾設(shè)備，美國Pall公司；FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1還原糖的檢測

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[14]。以葡萄糖質(zhì)量濃度(x，mg/mL)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，對其進行線性回歸后得到方程y=1.404 2x-0.017 7，該方程的相關(guān)系數(shù)為0.999 2，葡萄糖濃度的線性檢測范圍為0.10～0.70 mg/mL。還原糖的質(zhì)量濃度計算見式(1)。

(1)

式(1)中ρ為根據(jù)葡萄糖標準曲線計算得到待測提取液中葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為靈芝多糖提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為靈芝子實體超微粉質(zhì)量，g。

1.3.2多糖的檢測

采用蒽酮-硫酸法[15]。以葡萄糖質(zhì)量濃度(x，mg/mL)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，對其進行線性回歸后得到方程y=5.420 6x-0.077 3，該方程的相關(guān)系數(shù)為0.999 1，葡萄糖濃度的線性檢測范圍為0.04～0.18 mg/mL?？偺堑馁|(zhì)量濃度和多糖的提取率計算分別見式(2)和(3)。

(2)

ω(多糖)=[ω(總糖)-ω(還原糖)]×0.9×100%。

(3)

式(2)和(3)中，0.9為葡萄糖換算成葡聚糖校正系數(shù)，其他參數(shù)同1.3.1節(jié)。

1.3.3DPPH自由基清除率的測定

根據(jù)文獻[16]，稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL待測液，加入 2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，于波長525 nm處測吸光度(Ai)。以2 mL待測液和2 mL無水乙醇混合作為對照組(Aj)，另外2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液和2 mL無水乙醇混合后測吸光值(Ac)。DPPH自由基清除率計算見式(4)。

(4)

1.4 高壓熱水提取靈芝多糖工藝優(yōu)化

1.4.1單因素實驗

精確稱取靈芝子實體超微粉末 1.00 g，以蒸餾水為提取溶劑，分別研究提取溫度(110、115、120、125、130 ℃)、料液比 (即靈芝子實體超微粉質(zhì)量與提取溶劑體積的比例)(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)、提取時間(20、30、40、50、60 min)對靈芝總糖含量、還原糖含量和DPPH自由基清除率的影響。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，用L9(34)設(shè)計正交試驗研究提取溫度、提取時間、料液比對靈芝多糖提取的影響，對靈芝多糖高壓熱水提取工藝進行優(yōu)化。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3提取次數(shù)對靈芝多糖提取率影響的研究

根據(jù)正交試驗優(yōu)化確定的工藝，提取靈芝多糖。高壓熱水靈芝多糖提取液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，測定上清液中的總糖和還原糖含量。取棄去上清液后的固體多次重復(fù)提取，測定上清液中的總糖和還原糖含量。

1.5 靈芝多糖的純化

稱取50.00 g靈芝子實體超微粉，在較佳高壓熱水提取條件下提取多糖，5 000 r/min離心20 min后收集上清液，經(jīng)過3 000 Da膜超濾濃縮后，向溶液中加入其體積1/3的Sevag試劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)混合震蕩后靜置30 min，離心(4 000 r/min，5 min)，除去有機層及水層和有機層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)多次至無蛋白質(zhì)產(chǎn)生。除蛋白后的多糖，冷凍干燥保存，測定DPPH自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對靈芝多糖提取的影響

以料液比1∶50 g/mL、提取時間為30 min，考察110、115、120、125和130 ℃的提取溫度對靈芝多糖提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對靈芝多糖提取的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction efficiency of polysaccharides from Ganoderma lucidum

由圖1可以看出，隨著提取溫度的升高，靈芝多糖提取液中總糖含量和還原糖含量不斷增加，對DPPH自由基清除率不斷下降，當(dāng)溫度達到125 ℃時，總糖含量的增加不顯著，而還原糖含量顯著增加。這說明隨著溫度的升高，有助于多糖從細胞中的溶出，但高溫也導(dǎo)致多糖發(fā)生降解，其抗氧化活性也降低了。因此，選擇125 ℃作為較佳提取溫度。

2.2 料液比對靈芝多糖提取的影響

以提取溫度120 ℃、提取時間為30 min，考察1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70 g/mL的料液比對靈芝多糖提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對靈芝多糖提取的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of polysaccharides from Ganoderma lucidum

由圖2可以得知，在料液比為1∶30～1∶50 g/mL時，靈芝多糖提取液中總糖含量和對DPPH自由基清除率隨提取用水量的增加而增大；當(dāng)料液比為1∶50 g/mL時，總糖的含量和靈芝多糖提取液對DPPH自由基清除作用達到最大。而當(dāng)繼續(xù)增加提取用水量時，總糖含量反而有著緩慢下降。這可能的原因是，在1∶50 g/mL的料液比時，靈芝多糖的浸出已比較充分，繼續(xù)增加提取用水，含量沒有多大的變化，反而增加了升溫的時間。此外，提取用水的增加會增加其他組分(如蛋白質(zhì))的溶出，對于多糖的溶解可能存在一定影響。同時，在不同的料液比下，靈芝多糖提取液中還原糖含量變化不明顯，說明料液比對靈芝多糖的降解影響不顯著。因此，選擇1∶50g/mL作為靈芝多糖提取的較佳料液比。

2.3 提取時間對靈芝多糖提取的影響

以料液比1∶50 g/mL、提取溫度120 ℃，考察20、30、40、50和60 min的提取時間對靈芝多糖提取的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對靈芝多糖提取的影響Fig.3 Effect of time on extraction efficiency of polysaccharides from Ganoderma lucidum

由圖3可以看出，在20～60 min內(nèi)，靈芝多糖提取液中還原糖含量隨著時間的增加不斷升高，呈線性增長；而總糖含量的增長在30 min后趨于平緩。這可能是因為高壓熱水提取靈芝多糖是一個固液非均相的提取過程，需要一定的時間才能使多糖從固體內(nèi)部傳遞到液體，因此總糖含量隨時間的增加而增大；而在30 min后，固液體中多糖達到平衡，繼續(xù)增加提取時間對總糖含量的影響較小，但時間的延長存在多糖的分解。同時，在20～40 min內(nèi)，靈芝多糖提取液對DPPH自由基清除率不斷增加，而在40 min后，靈芝多糖提取液對DPPH自由基清除作用不斷下降。因此，選擇30 min作為較佳的提取時間。

2.4 正交試驗

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交表，對高壓熱水提取靈芝多糖提取工藝進行正交試驗優(yōu)化，實驗結(jié)果和分析結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

從表1中極差分析結(jié)果可以看出，3個因素對靈芝多糖提取率的影響由大到小依次為料液比(B)、提取時間(C)和提取溫度(A)。在實驗設(shè)計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到高壓熱水提取靈芝多糖的較佳條件為A2B2C2，即提取溫度為125 ℃、料液比1∶50 g/mL、提取時間30 min。該組合沒有在正交試驗的9個組合中出現(xiàn)，驗證實驗結(jié)果表明，在此條件下高壓熱水提取靈芝多糖的提取率為4.54%。相比較常壓熱水(在料液比1∶50 g/mL、提取溫度95 ℃、提取時間30 min條件下，多糖的提取率為3.01%)來說，高壓熱水提取靈芝多糖的提取率提高了50%以上。

2.5 提取次數(shù)對靈芝多糖提取的影響

以提取溫度為125 ℃、料液比1∶50 g/mL、提取時間30 min，考察高壓熱水提取次數(shù)對靈芝多糖提取的影響，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，隨著抽提次數(shù)的增加，多糖的提取率越來越低，第一次提取的多糖占4次提取多糖總量的53.47%，2次提取的多糖含量可達6.78%，占總提取量的80%以上，3次提取的多糖占總提取量的93%以上，因此可見在高壓熱水條件下，靈芝子實體多糖提取只需提取 2～3 次，即可提取出絕大部分多糖。

表2 提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響

2.6 靈芝多糖對DPPH自由基清除率的影響

靈芝多糖對DPPH自由基的清除作用如圖4。

圖4 靈芝多糖對DPPH·消除率的影響Fig.4 Effect of polysaccharides from Ganoderma lucidum on scavenging activity of DPPH radicals

由圖4可知，靈芝多糖具有清除DPPH自由基的能力，而且清除能力隨多糖濃度的增加逐漸增強，表明靈芝多糖對DPPH自由基的清除率與多糖含量存在量效關(guān)系。

3 結(jié) 論

靈芝子實體細胞的細胞壁具有細胞壁是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的致密結(jié)構(gòu)，通過高壓熱水提取，可以提高水對細胞穿透力和細胞破壞力，能有效加快多糖的釋放。以靈芝子實體超微粉為原料，研究了在高壓熱水條件下提取溫度、時間和料液比對靈芝多糖的提取以及提取液對DPPH自由基清除率的影響。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，靈芝多糖提取率隨著提取溫度升高、時間增加和料液比增大而增大，但高溫高壓也會促進靈芝多糖分解，影響其對DPPH自由基清除作用。通過正交試驗優(yōu)化，得到靈芝多糖高壓熱水提取優(yōu)化條件為料液比1∶50g/mL、提取溫度125 ℃、提取時間為30 min，在此條件下，一次高壓熱水提取靈芝多糖提取率達到4.54%，相較于常壓熱水提取法來說，多糖提取率顯著提高?？寡趸瘜嶒灲Y(jié)果表明，靈芝多糖對 DPPH 自由基有一定的清除能力，且與多糖質(zhì)量濃度存在一定的量效關(guān)系。

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