宋 杏， 尤 宏， 李福贊， 牟光慶, 李新玲, 妥彥峰,*

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院/大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116034； 2.新疆天潤生物科技股份有限公司， 新疆 烏魯木齊 830088)

生物膜是附著于活性或惰性實(shí)體表面的菌體及由菌體自身分泌的水合多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)包裹而形成的大量微生物聚集體[1]。生物膜態(tài)的單增李斯特菌的生物學(xué)特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、致病性及對環(huán)境因子的敏感性等均與浮游菌有很大差異[2]，對常規(guī)藥物和宿主免疫防御機(jī)制的耐受能力增強(qiáng)了2～1 000倍，是菌體產(chǎn)生耐藥性難以控制的主因[3]。

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)簡稱單增李斯特菌，是李斯特菌屬中對人致病性最強(qiáng)的菌種[4]。一般情況下，孕婦、老年人、幼兒等機(jī)體免疫力低下的人群易出現(xiàn)李斯特菌病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等臨床并發(fā)癥[5],住院患者致死率高達(dá)30%～40%[6]。多項(xiàng)研究證實(shí)，單增李斯特菌能在短時(shí)間內(nèi)黏附于聚苯乙烯、玻璃和不銹鋼表面并形成生物被膜[7]。目前，李斯特菌感染只能用抗生素類藥物進(jìn)行治療，然而單增李斯特菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥性，使得單增李斯特菌生物膜感染具有長期性和反復(fù)性，難以根除[8]。

如何有效控制LM生物膜形成日益成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，乳桿菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)對腐敗菌和致病菌及其生物膜具有良好的抑制作用[9]。文章分析了非殺菌劑量的Y42上清對LM生物膜形成的抑制作用，為LM生物膜的控制提供了新選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件

植物乳桿菌Y42與LM的純化菌種均采用甘油冷凍法保存，置于大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱。植物乳桿菌Y42接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)。LM接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng), 培養(yǎng)結(jié)束后，將LM濃度調(diào)為1.0×107CFU/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SX-500型自動高壓滅菌器，日本Tomy Digital BioLogy公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Z326K型冷凍離心機(jī)，德國HERMLE Labortechnlk GmbH公司；ALpha 1-2型真空凍干機(jī)，德國Marin Christ公司；BPH-9082型精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Multiskan GO-1510型酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific公司；KQ5200D型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DGG9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Y42上清的制備及冷凍干燥

活化的植物乳桿菌Y42菌株接種在30 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，使用冷凍離心機(jī)在4 ℃ 8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，然后再經(jīng)0.22 μm無菌濾膜除去菌體，收集得到的濾液即為植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液(簡稱Y42上清)。將Y42上清在真空凍干機(jī)中冷凍干燥24 h后稱重，并于-20 ℃冰箱保存，使用時(shí)重溶于蒸餾水中配制成所需的質(zhì)量濃度。

1.3.2Y42上清最小抑菌質(zhì)量濃度的確定

根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會所述的建議，采用96孔酶標(biāo)板刃天青顯色法測定Y42上清對LM的最小抑菌質(zhì)量濃度，并根據(jù)需要稍作修改[10-11]，具體操作如下：Y42上清的凍干物重溶于蒸餾水中配制成240、120、60、30、15 mg/mL連續(xù)2倍稀釋的復(fù)溶液。 96孔酶標(biāo)板中，實(shí)驗(yàn)組加入160 μL LM(1×107CFU/mL)和20 μL Y42上清，設(shè)置只有LB培養(yǎng)基和刃天青的陽性對照組以及只有LM菌懸液和刃天青的陰性對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組都設(shè)置6個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各孔顏色變化，并在激發(fā)波長為530 nm、吸收波長為590 nm下用熒光酶標(biāo)儀測定熒光值。與陰性對照組熒光值有顯著性差異且未變色的孔對應(yīng)的Y42上清的質(zhì)量濃度被定義為Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的最小抑菌質(zhì)量濃度(minimal inhibit concentration，MIC)。從每孔內(nèi)取出100 μL涂布到LB營養(yǎng)瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)不超過5個的平板所對應(yīng)的上清液質(zhì)量濃度被定義為Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液的最小殺菌質(zhì)量濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。配置質(zhì)量濃度為1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC和1/32 MIC的Y42上清。

1.3.3LM在1/2 MIC Y42上清作用下生長曲線的測定

測定浮游LM在1/2 MIC Y42上清作用下的生長曲線[12]：將LM(100 μL，1×107CFU/mL)接種于5 mL無菌LB培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組加入12 μL 1/2 MIC Y42上清，對照組加入12 μL無菌LB培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每隔3 h收集等分試樣測定OD600，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.4Y42上清對LM生物膜形成的抑制作用

(1)

1.3.5LM生物膜的顯微鏡觀察

根據(jù)回麗媛等[14]所述的方法通過光學(xué)顯微鏡觀察LM在蓋玻片上形成的生物膜，并根據(jù)需要稍作修改，具體操作如下：將1 cm×1 cm無菌蓋玻片置于含有2 mL新鮮LB培養(yǎng)基的6孔酶標(biāo)板內(nèi)，所述LB培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充有200 μL濃度分別為1/2 MIC，1/4 MIC，1/8 MIC，1/16 MIC、1/32 MIC的Y42上清和20 μL(1×107CFU/mL)LM菌懸液懸液。對照孔內(nèi)只含有2 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h，然后用0.1 mol/L PBS(pH值7.3)沖洗3次，除去未黏附的菌體，用質(zhì)量濃度0.1 g/mL結(jié)晶紫染色5 min，再次洗去蓋玻片上未結(jié)合的染液，晾干后在光學(xué)顯微鏡10×40放大倍數(shù)下觀察在蓋玻片上形成的生物膜。

1.3.6Y42上清對LM爬行運(yùn)動性的影響測定

實(shí)驗(yàn)采用Li等[15]所述的軟瓊脂法分析植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液對LM爬行運(yùn)動性的影響，并稍作修改：將50 μL過夜培養(yǎng)的LM(1×107CFU/mL)菌懸液接種于5 mL含1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC和1/32 MIC Y42上清的LB培養(yǎng)基中，以未加入上清液的一組作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃ 1 000 r/min 條件下離心10 min，收集菌體，用無菌PBS(pH值7.3)洗3次并制成5 mL PBS重懸液。取10 μL重懸液接種于軟瓊脂平板(體積分?jǐn)?shù)0.3%瓊脂)的中心進(jìn)行斑點(diǎn)接種，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量LM的爬行運(yùn)動直徑。

1.3.7數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用IBMSPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(ANOVE，LSD)。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，在95%水平用ANOVA分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y42上清MIC和MBC的測定結(jié)果

通過96孔酶標(biāo)板刃天青顯色法和涂布法得到的植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液對LM的MIC和MBC結(jié)果如圖1。由1(a)刃天青顯色結(jié)果可知，經(jīng)240、120和60 mg/mL Y42上清處理后，刃天青沒有被LM還原為粉紅色或粉紫色，而是保持刃天青和Y42上清混合后的顏色；而30 mg/mL Y42上清作用下的刃天青被LM菌體還原為粉紅色。由圖1(b)所示熒光檢測結(jié)果可知，經(jīng)15 mg/mL和30 mg/mL Y42上清熒光值與陰性對照組無顯著性差異，而60 mg/mL Y42上清熒光值與陰性對照組存在顯著性差異(p<0.05)。綜合以上結(jié)果可以確定Y42上清對LM的MIC為60 mg/mL。由圖1(c)所示涂布結(jié)果可知，120 mg/mL Y42上清作用下未看到LM單菌落的生長，因此120 mg/mL Y42上清可將LM完全致死，因此，Y42上清的MBC為120 mg/mL。

圖1 Y42上清抑制LM的MIC和MBCFig.1 MIC and MBC of L. plantarum-Y42 cell free fermentation supernatant against LM

2.2 1/2 MIC Y42上清作用下LM生長曲線的測定結(jié)果

為了排除由于乳桿菌發(fā)酵上清液抑制浮游LM生長而導(dǎo)致生物膜形成量減少的干擾作用，選擇質(zhì)量濃度1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的Y42上清作用于LM生物膜形成過程。浮游LM在1/2 MIC的上清作用下的生長曲線結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，1/2 MIC Y42上清作用下LM的生長雖然與對照組相比稍有滯后，但并沒有受到顯著抑制甚至致死，因此可將1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC及1/32 MIC等質(zhì)量濃度用于非殺菌劑量的植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液對LM生物膜的抑制研究。

圖2 1/2 MIC Y42上清作用下LM的生長曲線Fig.2 Growth curves of LM in the presence or absence of 1/2 MIC of L. plantarum-Y42 fermentation supernatant

圖3 Y42上清對LM生物膜形成的抑制率Fig.3 Biofilm formation inhibition rate of L. plantarum-Y42 fermentation supernatant on LM

2.3 Y42上清對LM生物膜形成抑制率的測定結(jié)果

采用微孔板結(jié)晶紫染色法測定了不同抑菌濃度植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液對LM生物膜形成的抑制率，結(jié)果如圖3。Y42上清的質(zhì)量濃度分別為1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC時(shí)，對LM生物膜形成的抑制率分別為32.90%、30.81%、40.75%、39.93%、12.15%，LM生物膜的形成均顯著低于對照組(p<0.05)。

之前已有研究表明，乳酸菌的無細(xì)胞發(fā)酵上清液具有抑制LM生物膜形成的作用。 Camargo等[16]發(fā)現(xiàn)含細(xì)菌素的乳酸菌無細(xì)胞上清液具有防止生物膜形成的潛力。Winkelstr?ter等[17]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌FT259及其細(xì)菌素可降低LM生物膜的形成。本研究中植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液中何種物質(zhì)發(fā)揮了抑制單增李斯特氏菌生物膜的形成，還有待進(jìn)一步研究。

2.4 LM生物膜的顯微鏡觀察

通過光學(xué)顯微鏡定性觀察不同濃度植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用下，LM黏附在蓋玻片上形成的生物膜(見圖4)。在10×40的放大倍數(shù)下，未經(jīng)Y42上清作用的LM菌體細(xì)胞中，一些分散的菌體相連接，大部分菌體細(xì)胞邊界不清晰，彼此部分重疊，黏結(jié)成團(tuán)塊，形成生物膜的典型結(jié)構(gòu)單元。而1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC及1/2 MIC Y42上清作用下的LM菌體間很少有黏結(jié)，大部分分散分布，且黏附在蓋玻片上的菌體數(shù)量明顯比不含Y42上清的一組少。由此可知，Y42上清能夠抑制LM的聚集、黏附、生物膜的形成甚至能夠使生物膜的三維結(jié)構(gòu)坍塌，使膜內(nèi)菌體從原生物膜中脫離，重新成為浮游菌體。

2.5 Y42上清對LM爬行運(yùn)動性的影響

不同濃度植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用下LM爬行運(yùn)動直徑的結(jié)果如圖5，Y42上清的質(zhì)量濃度分別為0、1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時(shí)，LM的爬行運(yùn)動直徑分別為81.15、78.31、75.35、69.51、54.91、33.09 mm，均顯著小于對照組(p<0.05)。

圖4 顯微鏡下觀察Y42上清對LM生物膜生物量的影響Fig.4 Effects of L. plantarum-Y42 fermentation supernatant on biofilm biomass of LM under microscope

圖5 Y42上清對LM爬行運(yùn)動性的影響Fig.5 Effects of L. plantarum-Y42 fermentation supernatant on swarming motility of LM

LM有4根周毛和1根端毛，對于LM來說，鞭毛并不是一個黏附器官，而是其重要的運(yùn)動器官。菌體可依賴鞭毛朝向有高濃度營養(yǎng)物質(zhì)的方向移動，而避開對其有害的環(huán)境，而且研究表明，LM的初始黏附、生物膜形成、入侵宿主及抗生素敏感性與LM的爬行運(yùn)動性有關(guān)[18-19]。已有研究證明在LM生物膜形成的初始階段，鞭毛的物理吸附十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的鞭毛、纖毛、菌毛能夠起到穩(wěn)定基質(zhì)的作用[20],對生物膜的形成起著重要的促進(jìn)或抑制作用[21]。Gowrishankar等[22]研究海洋源環(huán)狀二肽對LM生物膜形成和毒力的抑制作用，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀二肽作用于LM抑制其運(yùn)動性后，LM黏附性降低，生物膜形成受到了抑制。此外，突變研究發(fā)現(xiàn)鞭毛減少和鞭毛癱瘓的突變體在LM的表面初始黏附和生物膜形成過程中具有類似的缺陷，表明鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動性在LM生物膜形成過程中具有重要作用[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液能夠顯著抑制LM的爬行運(yùn)動性，由此推測，LM爬行運(yùn)動受抑制可能是其生物膜形成量減少的一個原因。

3 結(jié) 論

文章研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液可抑制單增李斯特氏菌生長，而在低于Y42上清最小抑菌質(zhì)量濃度條件下，可抑制單增李斯特氏菌的運(yùn)動性及生物膜的形成。植物乳桿菌Y42無細(xì)胞培養(yǎng)上清液中何種物質(zhì)抑制單增李斯特氏菌生物膜形成及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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