趙鋼,馬瑩瑩,付嘉明

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“標(biāo)本配穴”電針對(duì)心肌缺血模型大鼠心臟功能和細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

趙鋼,馬瑩瑩,付嘉明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

通過(guò)“標(biāo)本配穴”電針對(duì)針刺心肌缺血大鼠治療前后心臟功能和細(xì)胞凋亡指數(shù)影響的實(shí)驗(yàn)研究,觀察治療療效,從而探討針刺預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制,為臨床治療該病提供科學(xué)的方法。40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分成正常組、模型組、內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組。采取連續(xù)14 d腹部皮下注射異丙腎上腺素造模。正常組、模型組大鼠只抓取固定,不針刺治療。內(nèi)關(guān)組電針雙側(cè)內(nèi)關(guān),標(biāo)配組電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)、關(guān)元、雙側(cè)足三里,每日治療1次,共21 d。大鼠于第22天行超聲心動(dòng)圖機(jī)檢測(cè)大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS);TUNEL法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。模型組大鼠LVEDd、LVESD高于正常組(＜0.01),而LVEF、LVFS值均低于正常組(＜0.01);內(nèi)關(guān)組和標(biāo)配組LVEDd、LVESD均低于模型組(＜0.01),標(biāo)配組低于內(nèi)關(guān)組(＜0.01,＜0.05);內(nèi)關(guān)組和標(biāo)配組中LVEF、LVFS值均高于模型組(＜0.01),標(biāo)配組高于內(nèi)關(guān)組(＜0.05)。正常組大鼠心肌AI值低于模型組(＜0.01);內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組均低于模型組(＜0.01);標(biāo)配組低于內(nèi)關(guān)組(＜0.05)。電針能夠通過(guò)降低心肌缺血模型大鼠的LVEDd、LVESD值,提升LVEF、LVFS值,有效改善心肌缺血細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的代償性心臟擴(kuò)張、心功能低下,降低心肌細(xì)胞凋亡程度,且“標(biāo)本配穴”電針?lè)ū葐渭儍?nèi)關(guān)電針?lè)ň哂懈玫男?yīng)。

標(biāo)本配穴;電針;心肌缺血;心臟功能;細(xì)胞凋亡指數(shù);大鼠

現(xiàn)今心血管疾病嚴(yán)重威脅著人們的健康,其中心肌缺血是主要病因。針刺作為預(yù)防和治療心肌缺血的有效方法,為人們的健康提供了綠色的治療方案[1]。研究證明針刺對(duì)抗缺血心肌具有確切的保護(hù)作用,并且針刺不同腧穴或穴位配伍治療心肌缺血療效具有差異性。

心肌缺血發(fā)生后心臟室壁心肌組織、心腔結(jié)構(gòu)及心臟功能發(fā)生改變,而針對(duì)性的治療可以有效地改善這些狀況[2]。本研究通過(guò)建立大鼠心肌缺血模型,觀察電針尤其是“標(biāo)本配穴”電針?lè)▽?duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)功能和心肌組織細(xì)胞凋亡狀況的影響,以期探索其對(duì)心臟的保護(hù)效果及保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本課題選用SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只,由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供。飼養(yǎng)室溫20～25℃,濕度50%～70%,體重180～220 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)心電圖無(wú)異常。動(dòng)物喂養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房,每籠5只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵照科技部(2006)398號(hào)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》文件要求執(zhí)行[3]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備

40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、內(nèi)關(guān)電針組(內(nèi)關(guān)組)、標(biāo)本配穴電針組(標(biāo)配組),每組10只。模型組、內(nèi)關(guān)組和標(biāo)配組大鼠用鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenolhydrochloride,ISO)2 mg/ (kg·d)腹部皮下注射法[4-5],連續(xù)14 d,2周后用BL-420生物機(jī)能系統(tǒng)檢測(cè)模型組大鼠心電圖,以QRS波和QT波持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)(QRS＞0.1 s)[6-7];ST段壓低(ST＞0.1 mV),T波倒置,作為造模成功的標(biāo)志[8];正常組大鼠給予等量0.9%生理鹽水皮下注射,連續(xù)14 d。模型制備過(guò)程中無(wú)實(shí)驗(yàn)大鼠脫落。

參照李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]取穴,內(nèi)關(guān)位于大鼠前臂下1/6折點(diǎn)處,尺、橈骨縫中,腕橫紋正中上5 mm處,針刺深度約2 mm;關(guān)元位于大鼠兩后肢根部連線(xiàn)的中點(diǎn),針刺深度約4 mm;足三里位于大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約5 mm處,針刺深度約8 mm。

造模后穿自制大鼠固定衣[10],正常組、模型組大鼠只抓取固定,不針刺治療;內(nèi)關(guān)組針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān),標(biāo)配組針刺內(nèi)關(guān)、關(guān)元、足三里,標(biāo)配組同側(cè)穴位組成一對(duì)電極,內(nèi)關(guān)組及標(biāo)配組單穴在穴位右旁開(kāi)5 mm處另皮下淺刺一針,作為輔助電極;針刺后連接G6805-Ⅱ電針儀,選連續(xù)波,頻率2 Hz,電流強(qiáng)度均為1 mA,強(qiáng)度以大鼠出現(xiàn)與電針頻率相一致的輕微顫動(dòng)為宜,通電20 min。每日治療1次,共21 d。

1.3 結(jié)果檢測(cè)

1.3.1 心臟結(jié)構(gòu)與功能觀測(cè)

超聲心動(dòng)圖檢測(cè)[11]大鼠左室舒張末期、收縮末期內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率。大鼠在第22天,經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,以備皮刀心前區(qū)剃毛,仰臥固定于鼠板上,應(yīng)用Agilent Sonos 5500型彩色超聲心動(dòng)圖診斷儀,10S探頭,頻率為8 MHz,對(duì)大鼠的心臟大小及功能進(jìn)行檢測(cè)[12]。檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD),并計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)[13]。

1.3.2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)

大鼠在檢測(cè)心臟彩超后,開(kāi)胸暴露心臟,迅速摘取大鼠心臟用生理鹽水清洗,取心尖組織置于4%多聚甲醛固定備用[14]。檢測(cè)步驟如下,①將大鼠心室切片100 mg,將其先后用二甲苯、無(wú)水乙醇、乙醇(95%、85%、75%梯度脫蠟水化)依次進(jìn)行浸泡,再用蒸餾水浸泡洗滌2 min。②洗滌后的標(biāo)本滴入20mg/mL的蛋白酶K液,在20～37℃條件下反應(yīng)15 min,然后用PBS洗滌3次,每次洗滌5 min。③將裝有檢測(cè)標(biāo)本的EP管中添加50mL TUNE反應(yīng)液,在37℃條件下避光孵育60 min,然后放入PBS液中洗滌3次,每次洗滌5 min。④然后在標(biāo)本上加入50mL過(guò)氧化物酶,在37℃條件下避光孵育30 min。⑤再用PBS液洗滌4次,每次5 min,然后添加100mL DAB的顯色液,在室溫下進(jìn)行5 min的顯色,后用純凈水洗滌使顯色終止。⑥將顯色后的標(biāo)本復(fù)染,時(shí)間控制在30 s至1 min之間,然后用水洗滌,再用1%鹽酸乙醇使之分化,后用純凈水沖洗使之返藍(lán)。⑦將復(fù)染后的標(biāo)本用95%乙醇進(jìn)行脫水,時(shí)間為5 min,后用無(wú)水乙醇反復(fù)脫水2次,每次時(shí)間為3 min,二甲苯透明2次,每次時(shí)間為2 min,后將標(biāo)本放入通風(fēng)櫥中進(jìn)行風(fēng)干,用中性樹(shù)膠對(duì)標(biāo)本進(jìn)行封片[15]。⑧利用顯微鏡觀察晾干后的標(biāo)本切片。組織切片上的凋亡細(xì)胞在顯微鏡下(放大倍數(shù)為100倍和400倍)為棕褐色,采用計(jì)數(shù)方式標(biāo)記出標(biāo)本中心肌凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞的數(shù)目,后計(jì)算出細(xì)胞的凋亡率[16]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并對(duì)各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性分析,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的類(lèi)型分析結(jié)果選擇相應(yīng)的分析方法,依次采用單因素方差分析(-法)或運(yùn)用-非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)心肌缺血大鼠心臟功能的影響

模型組的左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)均高于正常組(＜0.01),左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)均低于正常組(＜0.01)。內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組中LVEDd值均低于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);標(biāo)配組中LVEDd值低于內(nèi)關(guān)組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組中LVESD值均低于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);標(biāo)配組中LVESD值低于內(nèi)關(guān)組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組中EF值均高于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);標(biāo)配組中EF值高于內(nèi)關(guān)組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組中FS值均高于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);標(biāo)配組中FS值高于內(nèi)關(guān)組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠LVEDd、LVESD、EF、FS值比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型組比較3)＜0.01;與內(nèi)關(guān)組比較4)＜0.05

2.2 電針對(duì)心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的影響

模型組大鼠心肌細(xì)胞AI值均高于正常組,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。內(nèi)關(guān)組、標(biāo)配組大鼠心肌細(xì)胞AI值均低于模型組,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);標(biāo)配組心肌細(xì)胞AI值低于內(nèi)關(guān)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見(jiàn)表2。通過(guò)組織染色看出標(biāo)配組與內(nèi)關(guān)組均能有效地改善實(shí)驗(yàn)大鼠的心肌缺血情況下心臟生理及心肌功能低下的狀況,并且標(biāo)配組電針?lè)ㄖ委熅哂懈玫寞熜?。詳?jiàn)圖1。

表2 各組大鼠AI值比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與內(nèi)關(guān)組比較3)＜0.05

3 討論

3.1 大鼠處于心肌缺血狀態(tài)時(shí)心臟結(jié)構(gòu)變化及選穴原則

持續(xù)、嚴(yán)重的心肌缺血將造成大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡,進(jìn)而可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)特別是左心室的構(gòu)型發(fā)生病變,表現(xiàn)為缺血區(qū)的心室肌出現(xiàn)代償性增厚,致使左心室腔隙發(fā)生縮小[17],進(jìn)而導(dǎo)致心室肌力減退,泵血功能下降,造成血液動(dòng)力學(xué)障礙和心功能降低[18];電針“標(biāo)本配穴”法治療心肌缺血的總有效率達(dá)80%以上[19],通過(guò)“標(biāo)本配穴”治療既可以顯著地緩解大鼠心肌缺血引發(fā)的心絞痛癥狀,還可以有效地改善大鼠的心電圖及心臟功能,減少心肌細(xì)胞的凋亡[20]。腧穴配伍是針灸處方的主要內(nèi)容之一,其目的是加強(qiáng)腧穴間協(xié)同作用,提高療效。不同腧穴有其特異性,實(shí)驗(yàn)研究顯示[21],“標(biāo)本配穴”法是現(xiàn)今電針抗大鼠心肌缺血損傷的最優(yōu)方法,其顯效率優(yōu)于常規(guī)配穴法。

3.2 “標(biāo)本配穴”可以有效防治心肌缺血損傷

近來(lái)有采用中藥貼敷、穴位注射中藥、激光穴位治療、穴位埋針以及穴位按摩等方法,與其相比針刺“標(biāo)本配穴”法治療心肌缺血的臨床顯效時(shí)間最快、強(qiáng)度可控[21]、物理?yè)p傷小并可以增加機(jī)體的適應(yīng)性保護(hù)能力改善心肌缺血損傷[22]。

注:A為正常組,B為模型組,C為內(nèi)關(guān)組,D為標(biāo)配組。標(biāo)本Harris蘇木素染色,組織切片在顯微鏡下(×400倍)觀察凋亡細(xì)胞為棕褐色

通過(guò)“標(biāo)本配穴”法治療可以明顯減輕心肌缺血所引起的癥狀;并且心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),可以用數(shù)據(jù)表現(xiàn)出大鼠心肌缺血后心臟出現(xiàn)代償及心功能低下的情況。針刺可以提升心肌組織的活性,并通過(guò)有效抑制缺血細(xì)胞凋亡發(fā)揮防護(hù)作用?！皹?biāo)本配穴”法電針可能通過(guò)兩方面途徑共同參與防治心肌缺血,一方面改善左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左心室短軸縮短率(FS),并抑制左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD),從而提高心肌細(xì)胞抗損傷能力;另一方面降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI),減少心肌細(xì)胞凋亡,減輕心室結(jié)構(gòu)功能損傷。實(shí)驗(yàn)表明,通過(guò)“標(biāo)本配穴”電針?lè)軌蝾A(yù)防及治療缺血性心臟病,并服務(wù)于臨床。

3.3 問(wèn)題與展望

心肌缺血導(dǎo)致的心肌組織細(xì)胞凋亡信號(hào)通路研究是一個(gè)紛繁復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[23],而對(duì)這些信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)的研究是個(gè)復(fù)雜龐大的工程。針灸防治心肌缺血性心血管疾病也是一個(gè)多通道、多靶點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制[24],每條信號(hào)調(diào)控途徑也并非獨(dú)自發(fā)揮調(diào)控作用。本研究中只探討“標(biāo)本配穴”對(duì)心肌缺血模型大鼠心臟結(jié)構(gòu)、功能和細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)大鼠心肌缺血的影響,對(duì)于分子機(jī)制尚未深入剖析。下一步研究可從兩個(gè)方面進(jìn)行,一是對(duì)心肌缺血過(guò)程中相關(guān)的基因分子水平調(diào)控途徑進(jìn)行研究,探討已經(jīng)進(jìn)行科研的研究,找出關(guān)鍵基因;二是找出對(duì)心肌缺血具有直接的影響可能存在的未知的靶基因,為心肌缺血過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更清晰的闡釋[25]。

綜上所述,“標(biāo)本配穴”電針?lè)ň哂辛己玫目剐募∪毖淖饔?其機(jī)制可能是通過(guò)針刺腧穴后的改善心室結(jié)構(gòu)、功能,抑制心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而達(dá)到有效保護(hù)心肌的效果。

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Effect of “Secondary-primary Point Combination” Electroacupuncture on Cardiac Function and Apoptosis Index in a Rat Model of Myocardial Ischemia

150040,

To investigate the efficacy of “secondary-primary point combination” electroacupuncture by observing its effect on cardiac function and apoptosis index in myocardial ischemia rat to explore the mechanism by which acupuncture pretreatment protects cardiac muscles and provide a scientific method for clinical treatment of this disease.Forty rats were allocated, using a random number table, to normal, model, Neiguan and secondary-primary point combination groups. The model was made by 14 consecutive days of abdominal subcutaneous injection of isoprenaline. The normal and model groups were only grabbed and fastened and not given acupuncture. The Neiguan group received acupuncture at bilateral points Neiguan(PC6) and the secondary-primary point combination group, at point Guanyuan(CV4) and bilateral points Neiguan and Zusanli(ST36). Acupuncture was given once daily, for a total of 21 days. Left ventricular end-diastolic diameter (LVEDd), Left ventricular end-systolic diameter (LVESD), left ventricular ejection fraction (EF) and left ventricular fractional shortening (FS) were measured by echocardiography in the rats at day 22. Rat myocardial apoptosis index (AI) was determined by TUNEL.Cardiac LVEDd and LVESD were larger and EF and FS were lower in the model group than in the normal group (all＜0.01). LVEDd and LVESD were smaller in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and smaller in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.01,＜0.05), EF and FS were higher in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and higher in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.05). Rat myocardial AI was lower in the normal group than in the model group (＜0.01), lower in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and lower in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.05).Electroacupuncture can effectively alleviate compensatory cardiac dilatation and cardiac hypofunction caused by ischemic myocardial cell apoptosis and reduce myocardial cell apoptosis by decreasing LVEDd and LVESD and increasing EF and FS in a rat model of myocardial ischemia. “Secondary-primary point combination” electroacupuncture has a better effect than electroacupuncture at point Neiguan alone.

Secondary-primary point combination; Electroacupuncture; Myocardial ischemia; Cardiac function; Apoptosis index; Rats

R2-03

A

1005-0957(2018)04-0461-05

趙鋼(1958—),男,教授,Email:174625809@qq.com

馬瑩瑩(1993—),女,2017級(jí)碩士生,Email:174625809@qq.com

付嘉明(1990—),男,2014級(jí)碩士生,Email:174625809@qq.com

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.04.0461

2017-10-20