王　祺　吳惠敏　倪茜茜　華　靜

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科　上海市消化疾病研究所(200001)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種除外乙醇和其他明確因素所致的以肝臟異常脂質(zhì)沉積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖等密切相關(guān)的代謝性肝損傷[1]。NAFLD的疾病譜包括單純性非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steato-hepatitis, NASH)、肝纖維化和肝硬化。Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝內(nèi)重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在慢性肝損傷炎癥和纖維化的始動(dòng) 和持續(xù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，然而，兩者在NAFLD進(jìn)展過(guò)程中表型和功能的改變與肝內(nèi)炎癥-纖維化的相關(guān)性尚不明確。本研究通過(guò)高脂飲食(high fat diet, HF飲食)和蛋氨酸膽堿缺乏飲食(methionine-choline deficient diet, MCD飲食)分別建立小鼠NAFL和NASH模型，觀察Kupffer細(xì)胞極化和HSC活化在NAFLD進(jìn)展中對(duì)肝內(nèi)炎癥-纖維化發(fā)展的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

SPF級(jí)健康雄性8周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

普通飲食、HF飲食、MCD飲食(Research Diets, Inc.)；大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體(GeneTex Inc.)；兔抗小鼠CD11c多克隆抗體(OriGene Technologies, Inc.)；兔抗小鼠CD206多克隆抗體、兔抗小鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體(Abcam plc.)；HRP標(biāo)記免疫組化二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TRIzolTM試劑(Invitro-genTM, Thermo Fisher Scientific)；real-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.)；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

二、方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模：C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control, NC)組、HF組MCD組，每組5只，分別予普通飲食12周、HF飲食12周和MCD飲食8周喂飼。造模結(jié)束后頸椎脫臼法處死，取肝臟組織用于后續(xù)檢測(cè)。

2. 肝臟組織病理學(xué)檢查：肝組織標(biāo)本4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，行HE和Masson染色。HE染色切片光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，參照亞太地區(qū)NAFLD評(píng)估和處理指南中的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估 NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score, NAS)[2]。①肝細(xì)胞脂肪變：<5%，0分；5%～33%，1分；34%～66%，2分；>66%，3分。②小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶)：無(wú)，0分；<2個(gè)，1分；2～4個(gè)，2分；>4個(gè)，3分。③肝細(xì)胞氣球樣變：無(wú)，0分；少見(jiàn)，1分；多見(jiàn)，2分。NAS總分0～8分，>4分診斷為NASH。Masson染色觀察纖維組織增生情況，NASH可伴有纖維化。肝細(xì)胞脂肪變>33%且不伴有小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和纖維化者為NAFL。

3. 肝組織免疫組化染色：肝組織切片烤片，脫蠟、水化，3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸鹽溶液高壓抗原修復(fù)，正常非免疫山羊血清封閉，分別滴加大鼠抗小鼠F4/80單克隆抗體(1∶50)、兔抗小鼠CD11c多克隆抗體(1∶50)、兔抗小鼠CD206多克隆抗體(1∶100)、兔抗小鼠α-SMA單克隆抗體(1∶300)，4 ℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫，滴加HRP標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，晾干，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算每視野陽(yáng)性細(xì)胞均值。

4. 肝組織real-time PCR：取少量?jī)龃娓谓M織，研磨后以TRIzolTM試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴(kuò)增，檢測(cè)炎癥、纖維化相關(guān)基因[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α-SMA、Ⅰ 型膠原蛋白(Col1)]和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)表達(dá)。目的基因引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1　PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、NAFL和NASH的肝臟組織病理學(xué)變化

HE染色顯示HF組小鼠肝組織內(nèi)見(jiàn)大量空泡樣脂肪變性細(xì)胞(>33%)，但未見(jiàn)明顯小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞氣球樣變，Masson染色未見(jiàn)纖維組織增生；MCD組小鼠肝組織內(nèi)見(jiàn)彌漫空泡樣脂肪變性細(xì)胞(>66%)，伴有明顯小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(>4個(gè)壞死灶)，可見(jiàn)少量肝細(xì)胞氣球樣變，Masson染色見(jiàn)竇周和靜脈周圍較多纖維組織增生，NAS評(píng)分均>4分(圖1)。上述發(fā)現(xiàn)提示HF飲食和MCD飲食分別誘導(dǎo)NAFL模型和NASH模型成功。

二、NAFL和NASH時(shí)肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞極化和HSC活化情況

免疫組化染色顯示，HF組(NAFL)和MCD組(NASH)小鼠肝內(nèi)F4/80陽(yáng)性Kupffer細(xì)胞較NC組明顯增加，且以CD11c陽(yáng)性M1型巨噬細(xì)胞增加為主，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCD組上述改變較HF組更為顯著(P<0.05)。兩組均未檢測(cè)到明顯CD206陽(yáng)性M2型巨噬細(xì)胞。HF組和MCD組小鼠肝內(nèi)α-SMA陽(yáng)性HSC較NC組明顯增加，MCD組較HF組增加更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

三、NAFL和NASH時(shí)肝內(nèi)炎癥、纖維化相關(guān)基因表達(dá)變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，HF組(NAFL)和MCD組(NASH)小鼠肝內(nèi)TNF-α、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較NC組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝內(nèi)α-SMA、Col1 mRNA相對(duì)表達(dá)量增高僅在MCD組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1　小鼠NAFL和NASH模型肝臟組織病理學(xué)變化(×200)

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

四、NAFL和NASH時(shí)肝內(nèi)PPAR-γ基因表達(dá)變化

Real-time PCR結(jié)果顯示，HF組(NAFL)小鼠肝內(nèi)PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于NC組，MCD組(NASH)小鼠肝內(nèi)PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

討　　論

在NAFLD進(jìn)展的疾病譜中，NASH是最關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)，可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化。晚近研究顯示天然免疫在NAFLD發(fā)病中發(fā)揮重要作用，免疫調(diào)控失敗或障礙所致的免疫-炎癥相關(guān)信號(hào)通路活化可能是啟動(dòng)和促進(jìn)NAFL向NASH甚至肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵因素[3]。Kupffer細(xì)胞是定居于肝臟的機(jī)體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，其活化后不僅可釋放多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子，還調(diào)控著周圍細(xì)胞的表型和功能，尤其是Kupffer細(xì)胞與其他細(xì)胞間的相互作用可影響疾病進(jìn)程。HSC表型由靜息型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨鲋承褪歉卫w維化形成和進(jìn)展的中心 環(huán)節(jié)。作為肝臟內(nèi)兩種重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，Kupffer細(xì)胞與HSC間的交互作用可能在慢性肝損傷炎癥和纖維化的始動(dòng)和持續(xù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性和可塑性，在不同微環(huán)境信號(hào)的作用下發(fā)生不同方向的極化，從而具有不同表型和功能。M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎、抗增殖、介導(dǎo)組織損傷作用，M2型巨噬細(xì)胞則發(fā)揮抑制炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)和重塑作用[4-5]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[6]發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠NASH的發(fā)生常伴隨肝內(nèi)M1/M2型巨噬細(xì)胞比值增高。本研究結(jié)果顯示，HF飲食誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠NAFL模型肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞均顯著增加，盡管未見(jiàn)明顯小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但促炎細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)增高。MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞與NAFL時(shí)相比進(jìn)一步增加，伴隨明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和TNF-α表達(dá)增高。上述發(fā)現(xiàn)提示HF飲食誘導(dǎo)的肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞M1型極化與NAFL時(shí)的肝內(nèi)低度炎癥有關(guān)；而在NASH階段，肝內(nèi)炎癥加重不僅與Kupffer細(xì)胞M1型極化有關(guān)，還與肝內(nèi)炎癥細(xì)胞募集有關(guān)。

HSC是肝組織損傷后修復(fù)時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。生理?xiàng)l件下，HSC處于靜息狀態(tài)，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)；肝臟損傷時(shí)，炎癥細(xì)胞釋放的促纖維化因子激活HSC，使其出現(xiàn)特征性的形態(tài)和功能轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)化為具有增殖、收縮功能的肌成纖維樣細(xì)胞，能合成大量膠原纖維，致使大量細(xì)胞外基質(zhì)和纖維組織形成[7]。目前研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌TGF-β1等促纖維化因子激活HSC[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠NAFL模型肝內(nèi)促纖維化因子TGF-β1表達(dá)已較正常飲食小鼠明顯增高，且免疫組化染色可見(jiàn)肝內(nèi)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞(活化HSC)明顯增加，同時(shí)肝內(nèi)α-SMA mRNA表達(dá)有所增高，但未見(jiàn)Col1表達(dá)明顯增高。而小鼠NASH模型肝內(nèi)TGF-β1和Col1表達(dá)均明顯增高，伴有更顯著的HSC活化，Masson染色見(jiàn)竇周和靜脈周圍較多纖維組織形成。由此推測(cè)NAFLD發(fā)展過(guò)程中肝纖維化的啟動(dòng)可能始于NAFL階段，以Kupffer細(xì)胞M1型極化為核心的局部天然免疫-炎癥反應(yīng)的持續(xù)活化可能啟動(dòng)了HSC的活化，但此種早期活化HSC的細(xì)胞功能尚未發(fā)生顯著變化；至NASH階段，Kupffer細(xì)胞亦或募集至肝臟的單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的促炎、促纖維化功能更加強(qiáng)大，從而進(jìn)一步激活HSC，促進(jìn)其發(fā)生表型和功能改變，推動(dòng)炎癥-纖維化進(jìn)展。

PPAR-γ屬于核激素受體超家族，是一種配體應(yīng)答型轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)配體激活實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)位而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[9]。既往研究[10]證實(shí)，PPAR-γ是巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化方向而影響機(jī)體炎癥反應(yīng)。本課題組前期研究[11]亦發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PPAR-γ表達(dá)可使脂質(zhì)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化由M1型向M2型轉(zhuǎn)移。PPAR-γ同樣能影響HSC的活性狀態(tài)，其表達(dá)上調(diào)能使HSC由活化增殖型轉(zhuǎn)變?yōu)殪o息型[12]。因此，PPAR-γ表達(dá)水平可能與肝內(nèi)炎癥-纖維化程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠NAFL模型肝內(nèi)PPAR-γ表達(dá)顯著增高，NASH模型肝內(nèi)PPAR-γ表達(dá)則顯著降低。筆者推測(cè)，盡管HF飲食可促進(jìn)Kupffer細(xì)胞M1型極化和早期HSC活化，但肝內(nèi)較高水平的PPAR-γ表達(dá)阻止了兩者的進(jìn)一步活化，因此NAFL階段肝內(nèi)僅有低度炎癥反應(yīng)；至NASH階段，PPAR-γ表達(dá)顯著下降可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞/Kupffer細(xì)胞的M1型極化并使HSC不斷活化，導(dǎo)致炎癥-纖維化反應(yīng)加劇，促進(jìn)疾病進(jìn)展。

綜上所述，在NAFLD進(jìn)展過(guò)程中，肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)的M1型極化，HSC在NAFLD早期已出現(xiàn)活化并隨疾病由NAFL向NASH進(jìn)展而加劇。Kupffer細(xì)胞極化和HSC活化促進(jìn)了NAFLD中肝臟炎癥-纖維化的啟動(dòng)和進(jìn)展，抑制肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞M1型極化和HSC活化則可減輕炎癥-纖維化。后續(xù)擬進(jìn)一步研究NASH發(fā)展過(guò)程中Kupffer細(xì)胞和HSC的表型、功能改變以及兩者間的交互作用，明確PPAR-γ對(duì)兩者活化和交互作用的影響，從而設(shè)計(jì)基于細(xì)胞特異性和病程階段性的調(diào)控治療靶點(diǎn)，為NAFLD的預(yù)防和治療提供新思路。

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