李濤，張媛媛

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島　266042)

1　概述

蘋果渣，主要由蘋果皮、種子以及漿狀物組成，為蘋果汁生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，每年都有大量蘋果渣產(chǎn)生。這種工業(yè)副產(chǎn)品是一種含有眾多物質(zhì)的混合物，其中就有幾種有前景的化合物，如不溶性碳水化合物、糖類、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及維生素[1]。雖然這種副產(chǎn)品沒有合適的處理方式，但一些蘋果加工企業(yè)已經(jīng)有所行動(dòng)，正在尋找經(jīng)濟(jì)上和技術(shù)上可行的手段來利用它們。蘋果渣是一種較便宜而且豐富的原料，研究人員提出利用蘋果渣生產(chǎn)酶、有機(jī)酸、富含蛋白質(zhì)的飼料、食用菌、乙醇、芳香族化合物和天然抗氧化劑，這是一個(gè)有現(xiàn)實(shí)意義的想法[2]。這些殘留物的再利用不僅將為工業(yè)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定做出貢獻(xiàn)，而且還有助于減少環(huán)境污染，促進(jìn)對天然生物資源的合理利用。

在蘋果渣所含物質(zhì)中，酚類化合物以及五環(huán)三萜類化合物占據(jù)大部分。如熊果酸(UA)，一種具有多種功能特性的五環(huán)三萜類化合物，由于其抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗菌的生物活性而被研究者廣泛關(guān)注[3]。雖然蘋果渣具有很大的再利用價(jià)值，但在世界范圍內(nèi)對蘋果渣的探索研究很少。因此，本綜述旨在強(qiáng)調(diào)蘋果和蘋果渣作為一種經(jīng)濟(jì)上可行的、潛在的生物活性化合物的來源，重點(diǎn)突出蘋果渣中UA的提取過程。

2　蘋果渣的經(jīng)濟(jì)性與熊果酸的提取

蘋果是種植最廣泛的樹果之一，屬于薔薇科蘋果屬，物種數(shù)量眾多，但具體數(shù)目未知。蘋果主要在溫帶栽培，但由于蘋果樹適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，故其廣泛分布在世界各地，超過95個(gè)國家擁有蘋果樹。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(2016年)公布的相關(guān)資料顯示，蘋果主要生產(chǎn)國是中國、美國、土耳其和波蘭，其中中國蘋果產(chǎn)量占世界蘋果產(chǎn)量的一半以上。近10年來，世界范圍內(nèi)蘋果種植面積增加了30%以上，對促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。

2.1　蘋果渣的利用

蘋果汁提取產(chǎn)生的固體殘留物“蘋果渣”，是在制汁過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品，占原始水果的30%左右。蘋果渣基本上由94.1%的果皮和4.1%的種子(濕重的數(shù)據(jù))組成[4]。在中國，每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸的蘋果渣[5]。然而，由于維生素和蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量低，營養(yǎng)價(jià)值低，因此其利用率有限。蘋果渣主要作為有機(jī)肥料或者動(dòng)物飼料，但這種處理方法可能對動(dòng)物健康和環(huán)境造成損害。

在過去20年中，每年有關(guān)蘋果渣的利用的出版物和引用量大幅增加。根據(jù)一些研究，蘋果渣可用作微生物生長的底物(發(fā)酵利用)和生產(chǎn)附加值產(chǎn)品，如有機(jī)酸、酶、單細(xì)胞蛋白、乙醇、沼氣、色素以及面包酵母等。蘋果中存在的大多數(shù)化合物保留在果渣中，包括不溶性碳水化合物(纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素)、簡單的糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)以及少量的酸、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及維生素等。故蘋果渣也被認(rèn)為是生物活性分子的來源，如膳食纖維、蛋白質(zhì)、生物聚合物和天然抗氧化劑[6]。此外，蘋果渣還是具有抗氧化潛力的一系列酚類化合物的良好來源。同時(shí)在蘋果中研究較少的其他成分，特別是角質(zhì)層、蠟層，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與抗氧化性、抗菌和抗腫瘤活性有關(guān)的萜類化合物[7]。因此，應(yīng)該進(jìn)行更多關(guān)于蘋果副產(chǎn)品作為生物活性化合物潛在來源的實(shí)用性研究。

萜類化合物是由植物產(chǎn)生的最多和最廣泛的次級代謝產(chǎn)物，由不同數(shù)量的異戊二烯單元(C5H8)組成。異戊二烯衍生的化合物通常是通過碳骨架的氧化或重排等化學(xué)修飾而得到的化合物。三萜類化合物是一組由6個(gè)異戊二烯單元重排得到的化合物(C30)，它們被認(rèn)為是具有廣泛有益生物活性的有前景的次級植物代謝產(chǎn)物[8]。

五環(huán)三萜類化合物，特別是那些具有羽扇豆烷、烏蘇烷及齊墩果烷骨架結(jié)構(gòu)的三萜類化合物，不僅顯示出幾種重要藥理活性，而且它們沒有顯著毒性。因此，這些三萜類化合物是用于開發(fā)新型治療劑的有前景的化合物[9]。烏蘇烷型三萜類化合物一個(gè)重要的代表就是熊果酸(3β-hydroxyurs-12-en-28-oic；UA)(見圖1)，又名烏蘇酸、烏索酸，純品為白色針狀結(jié)晶，分子式為C30H48O3，分子量為456.68，熔點(diǎn)為285～287 ℃，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、甲醇等。UA以游離酸的形式存在于各種各樣的植物中，或作為三萜皂苷的糖苷配基存在。蘋果皮中含有糖苷配基三萜類化合物，其中最豐富的三萜類化合物為UA，其次為其異構(gòu)化合物——齊墩果酸和樺木酸。因此，蘋果渣是UA的良好來源。

圖1　熊果酸(UA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of ursolic acid (UA)

2.2　從蘋果渣中提取、分離、純化和鑒定熊果酸

植物原料中提取三萜類化合物的常規(guī)提取技術(shù)有索氏提取、浸漬以及熱回流提取。三萜類化合物的提取方法和所用溶劑的選擇取決于起始原料。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，使用非極性溶劑的索氏萃取法是迄今為止分析提取最常用和最直接的方法。該技術(shù)對三萜類化合物具有良好的選擇性，回收率高，無需進(jìn)一步純化即可直接進(jìn)行色譜分析。

考慮到三萜類化合物是有前景的生物活性物質(zhì)，并考慮到工業(yè)副產(chǎn)品的殘留價(jià)值，研究者開發(fā)了一種從蘋果渣中提取UA的方法。最初，將蘋果渣干粉末用60%乙醇回流2 h，萃取液減壓除去乙醇后，殘余水相用乙酸乙酯萃取，得到的有機(jī)相在40 ℃下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至干，得到殘余物，用乙腈重結(jié)晶。重復(fù)該過程幾次，直至得到白色粉末[10]。

蘋果含有的大量碳水化合物干擾了UA的純化過程，為了除去極性化合物，Silva等對Innocente等的方案稍做修改進(jìn)行了操作：使用水進(jìn)行初提，將蘋果渣添加到100 ℃蒸餾水中煎煮10 min，重復(fù)數(shù)次(5～7次)，直到殘留的水變澄清。然后，過濾得到蘋果渣，將其放在循環(huán)空氣烘箱(40 ℃)中干燥，隨后用乙醇回流萃取。萃取液于40 ℃下減壓濃縮至干，得到的固體利用柱色譜純化(用二氯甲烷作為洗脫劑)得到UA[11]。2014年，Innocente等也采用煎煮法，但是減壓濃縮后得到的固體用乙酸乙酯/甲醇混合溶液(7∶3)進(jìn)行重結(jié)晶，而不是進(jìn)行柱色譜分離。雖然導(dǎo)致純化步驟延長，但是更經(jīng)濟(jì)也更方便，并且最后得到的產(chǎn)物為白色粉末[12]。

為了對提取方法進(jìn)行改進(jìn)，從煎煮步驟開始，將煎煮后殘?jiān)稍锖笤傺心?，用索氏萃取器進(jìn)行萃取。同時(shí)為了提高萃取選擇性，索氏萃取使用不同溶劑，如環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇等。除了索氏提取方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用外，通過薄層色譜(TLC)對獲得的不同溶劑提取物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有溶劑組分中都含有UA，這說明索氏提取方法適合于UA的提取。但是，僅在乙酸乙酯提取液中UA顯示出更高的產(chǎn)率和更高的純度，使用乙腈重結(jié)晶后，得到白色粉末狀的UA，收率為3.5%。其他溶劑提取物通過柱色譜純化后獲得UA，但是UA的產(chǎn)率非常低，沒有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，上述方法中(見圖2)，乙酸乙酯為萃取劑為UA的提取提供了理想的產(chǎn)率和純度，利用高效液相色譜(HPLC)估算純度約60%[13]。雖然還有其他提取方法如超聲輔助提取、酶解法、超臨界流體萃取法等[14-16]，但上述方法操作簡單方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此被認(rèn)為是從蘋果渣中提取UA的標(biāo)準(zhǔn)方法。

圖2　從蘋果渣中提取和純化熊果酸的流程圖Fig.2 Fluxogram illustrating the steps of ursolic acid extraction and purification from apple pomace

HPLC和GC是檢測、鑒定和分析三萜類化合物最普遍的技術(shù)。另外，HPLC-MS不僅為結(jié)構(gòu)鑒定提供了有價(jià)值的光譜信息，而且為其檢測提供了足夠的靈敏度；GC/MS是用于定性和定量分析異構(gòu)三萜類混合物(如熊果酸、齊墩果酸和樺木酸)的最合適的分析方法。但由于UA揮發(fā)性弱，需要進(jìn)行化學(xué)衍生化。最終，通過光譜方法(IR，1H和13C NMR和GC/MS光譜)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了UA的結(jié)構(gòu)。

3　總結(jié)

世界各地每天都會(huì)產(chǎn)出大量的蘋果渣。蘋果渣中含有許多具有對人類有益的生物活性化合物，將蘋果渣作為原料提取更有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物質(zhì)顯得非常有必要，但是現(xiàn)如今還沒有實(shí)現(xiàn)這一目的。熊果酸(UA)是一種三萜類化合物，具有許多對人體有益的生物活性，值得更多的重視與研究[17]。本文簡單介紹了從蘋果渣中提取UA的幾種方法，相信還有更多更有效的提取方法未曾發(fā)現(xiàn)，需要進(jìn)行更多相關(guān)方面的研究。

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