鐘方麗，金龍哲,王曉林*，谷月

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林　132022；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學院，吉林 延吉　133001)

香葉為植物香葉天竺葵的莖葉，我國各地均有栽培，全草具有清新芳香氣味，香葉含有芳香揮發(fā)油，其主要成分是芳樟醇、丁香油酚、香茅醇、桉葉素等[1,2]。香葉作為調(diào)味料常用于湯類或肉類烹調(diào)時的調(diào)味，也是西餐常用芳香調(diào)味料之一，香葉除了作為調(diào)味品使用外，尚具有祛風除濕、行氣止痛、殺蟲之功效[3]。香葉除含有芳香揮發(fā)油外，還含有大量的黃酮類成分[4]，而黃酮類化合物具有清除自由基、提高免疫力、抗衰老等多種生理活性，在藥品、飲料、食品領域應用廣泛[5-6]。離子液體是由有機陽離子和有機或無機陰離子組成的在室溫下呈液體的有機離子體系[7]。由于離子液體具有揮發(fā)性小、性質穩(wěn)定、溶解能力強等獨特的物理化學性質，現(xiàn)已在天然產(chǎn)物活性成分提取領域有所應用[8-10]，與傳統(tǒng)的有機溶劑相比，離子液體具有綠色環(huán)保、熱穩(wěn)定性好、不揮發(fā)、不易燃燒等特點，被認為是代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機溶劑更環(huán)保的溶劑[11]。因此，本研究采用離子液體輔助超聲技術，以香葉總黃酮提取率為評價指標，通過單因素和正交試驗優(yōu)化了香葉總黃酮的提取工藝條件，并探索了香葉對DPPH·的清除活性，為香葉的深入開發(fā)提供了試驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

香葉，購于亳州康民中藥材批發(fā)行；蘆丁，中國食品藥品檢定研究院(供含量測定用)；溴化-1-丁基-3-甲基咪唑、氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，上海成捷化學有限公司；纖維素酶，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；維生素C，天津市永大化學試劑有限公司；DPPH·，上海如吉生物科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇(均為分析純)，天津市永大化學試劑有限公司；水(重蒸餾水)；其余所用試劑(均為化學純)。

1.2　儀器與設備

TU-1950紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；W5-100SP恒溫水浴鍋上海申生科技有限公司；FA-3204B電子分析天平上海精密科學儀器有限公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9076A電熱鼓風干燥器上海精密實驗設備有限公司；KQ118超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1標準曲線的制備

稱取干燥至恒重的蘆丁10 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入50%乙醇水溶液，超聲使其溶解，定容，搖勻，使之成為每1 mL含0.1856 mg的蘆丁對照品溶液，備用。在7個容量瓶中分別放入蘆丁對照品溶液12.0，10.0，8.0，6.0，4.0，2.0，1.0 mL，于30 ℃水浴條件下，分別加入0.3 mL 的5% NaNO2溶液，輕輕振搖2 min，然后靜置6 min，向每個容量瓶中加入濃度為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，慢慢搖晃2 min，然后靜置6 min，再向每個容量瓶中加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，用50%乙醇定容，搖勻，放置15 min，以相應對照品溶液為空白，按照紫外可見分光光度法，于510 nm波長處測吸光度[12]。以濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，進行直線回歸，繪制標準曲線，蘆丁的線性范圍為0.007424～0.08909 mg/mL，回歸方程：A=10.3088C-0.04484，R=0.9993。

1.3.2樣品含量測定

精密吸取香葉提取液適量于25 mL容量瓶中，按1.3.1項下所述方法進行測定，以相應香葉提取液為空白，在510 nm波長處測吸光度，計算出總黃酮提取率，計算公式如下：

香葉總黃酮提取率(mg/g)=總黃酮的質量/香葉藥粉的質量。

1.3.3離子液體輔助提取香葉總黃酮的試驗

取香葉粗粉適量，放入到燒瓶中，加入適量的提取溶劑及離子液體，超聲波頻率設定為90 W，在一定的溫度下提取，過濾，然后將濾液定容至容量瓶中，按1.3.2節(jié)方法測定香葉提取液中總黃酮含量，以總黃酮提取率為指標，分別考察離子液體種類、離子液體濃度、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比、提取時間對總黃酮提取率的影響，并在單因素試驗基礎上，對主要影響因素進行正交試驗。

2　結果與分析

2.1　單因素提取試驗

2.1.1離子液體種類對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉5份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.5 mol/L的不同離子液體的50%乙醇水溶液，離子液體分別為溴化-1-丁基-3-甲基咪唑、氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，水浴溫度控制在50 ℃，料液比為1∶20(g/mL)，超聲波頻率為90 W，提取30 min，過濾，濾液用50%乙醇水溶液稀釋至適當?shù)娜萘科恐?。按“標準曲線的制備”中的方法測定提取液的吸光度值，選擇適宜提取香葉總黃酮的離子液體，試驗結果見表1。

表1　離子液體種類的選擇Table 1 Selection of ionic liquid species

由表1可知，離子液體為氯化-1-丁基-3-甲基咪唑時，香葉總黃酮的提取率最高，所以使用氯化-1-丁基-3-甲基咪唑進行后續(xù)試驗。

2.1.2提取溶劑乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉6份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.5 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的乙醇水溶液，乙醇體積分數(shù)分別為0，10%，30%，50%，70%，90%，其他操作同2.1.1節(jié)，試驗結果見圖1。

圖1　乙醇體積分數(shù)的影響Fig.1 The influence of ethanol volume fraction

由圖1可知，當乙醇體積分數(shù)小于30%時，隨著乙醇體積分數(shù)的上升，香葉總黃酮提取率不斷增加的趨勢非常明顯，當乙醇體積分數(shù)達到30%時，總黃酮提取率也達到了最高值56.23 mg/g。當乙醇體積分數(shù)高于30%時，隨著乙醇體積分數(shù)的持續(xù)上升，香葉總黃酮的提取率卻表現(xiàn)出不斷下降的趨勢。因為當乙醇體積分數(shù)達到30%時，香葉總黃酮的提取率達到最高值，所以選擇30%乙醇水溶液為后續(xù)試驗的提取溶劑。

2.1.3離子液體濃度對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉6份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的30%乙醇水溶液，其他操作同2.1.1節(jié)，試驗結果見圖2。

圖2　離子液體濃度的影響Fig.2 The influence of ionic liquid concentration

由圖2可知，當氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的濃度在0.05～0.3 mol/L范圍內(nèi)時，離子液體的濃度越高，香葉總黃酮的提取率越大，在其濃度提高到0.3 mol/L時，香葉總黃酮的提取率達到了峰值。而其濃度高于0.3 mol/L時，隨著離子液體濃度的增加，香葉總黃酮提取率略有降低的趨勢。由于離子液體濃度為0.3 mol/L時，香葉總黃酮提取率最大，所以選擇離子液體濃度為0.3 mol/L進行后續(xù)試驗。

2.1.4料液比對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉7份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.3 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的30%乙醇水溶液，料液比分別為1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，然后按照2.1.1節(jié)中的方法進行相關操作，具體試驗結果見圖3。

圖3　料液比的選擇Fig.3 The choice of solid-liquid ratio

由圖3可知，當料液比在1∶5～1∶20范圍內(nèi)時，隨著料液比的升高，香葉總黃酮提取率顯著增加，當料液比在1∶20～1∶50范圍內(nèi)時，隨著料液比的升高，香葉總黃酮提取率緩慢增加，當料液比持續(xù)升高到1∶50時，總黃酮提取率達到69.11 mg/g，繼續(xù)增加料液比，總黃酮提取率變化很小。分析原因可能是因為香葉的量固定，料液比太小，提取液粘度較大，不利于香葉總黃酮的溶出，難以保證香葉中總黃酮轉移到提取液中，提取不完全，總黃酮提取率較低，在一定程度上增加料液比有利于黃酮類物質向提取液轉移，從而使總黃酮提取率升高，但料液比過高其他非黃酮類物質的溶出也就越大，可能干擾總黃酮的含量測定，從而使香葉總黃酮的提取率表現(xiàn)出稍有降低的現(xiàn)象。所以采用1∶50的料液比進行后續(xù)的單因素試驗。

2.1.5水浴溫度對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉7份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.3 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的30%乙醇水溶液，料液比為1∶50，設定水浴提取溫度分別控制在30，40，50，60，70，80 ℃，其他操作同2.1.1節(jié)，試驗結果見圖4。

圖4　提取溫度的選擇Fig.4 The choice of extraction temperature

由圖4可知，隨著水浴溫度的升高，香葉總黃酮提取率逐漸提高，當水浴溫度達到60 ℃時，香葉總黃酮的提取率也增加到了最大值74.87 mg/g，繼續(xù)升高水浴溫度，總黃酮的提取率卻表現(xiàn)出不斷降低的趨勢。可能是因為隨著水浴溫度的不斷上升，使提取溶劑的運動速度及頻率不斷增大，使之更容易滲透到香葉組織細胞中，加速黃酮類物質的溶出，從而增加總黃酮的提取率。但溫度過高，可能會導致部分黃酮類化合物的結構被破壞，從而使提取率下降。所以選擇水浴提取溫度60 ℃進行后續(xù)試驗。

2.1.6提取時間對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉8份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，加入濃度為0.3 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的30%乙醇水溶液，料液比為1∶50，水浴溫度控制在60 ℃，然后按照2.1.1節(jié)中方法分別提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h，其他處理與2.1.1節(jié)中方法一致，試驗結果見圖5。

圖5　提取時間的選擇Fig.5 The choice of extraction time

由圖5的試驗數(shù)據(jù)可知，隨著提取時間的不斷延長，香葉總黃酮的提取率也隨著時間延長而升高，提取時間3.0 h時可使香葉總黃酮的提取率升高到93.03 mg/g，再延長提取時間，香葉總黃酮的提取率開始逐漸降低。其原因為延長提取時間可以使香葉中的總黃酮的溶出增加，但如果提取時間過長會使黃酮類化合物的結構被破壞，從而使提取率下降。所以選擇提取時間為3.0 h進行后續(xù)試驗。

2.2　離子液體輔助提取香葉總黃酮的正交試驗

2.2.1因素及水平的考察

在上述單因素試驗中，料液比達到1∶50后對香葉總黃酮提取率影響很小，所以在正交試驗中將料液比固定為1∶50，選擇氯化-1-丁基-3-甲基咪唑離子液體的濃度、提取溶劑乙醇的體積分數(shù)及提取時間和提取溫度作為因素進行考察，以香葉總黃酮提取率為考察指標，進行正交試驗，進一步優(yōu)化香葉總黃酮的提取工藝。按4因素3水平進行正交試驗設計L9(34)，見表2，在此條件下對香葉總黃酮進行提取，按1.3.2節(jié)方法測定提取液的吸光度，計算總黃酮提取率。

表2　正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

2.2.2正交試驗結果

取香葉粗粉9份，每份2 g，放入圓底燒瓶中，按正交試驗表進行試驗，每組試驗的料液比為1∶50，結果見表3。

表3　正交試驗設計及試驗結果Table 3 Orthogonal array design arrangement and the experimental data

正交試驗結果表明：離子液體超聲輔助提取香葉總黃酮各因素的影響大小為：提取時間影響最大，其次是提取溫度，然后為離子液體濃度，影響最小的是提取溶劑的乙醇體積分數(shù)，最佳離子液體超聲輔助提取香葉總黃酮的最佳工藝條件為A3B3C2D3，即離子液體為氯化-1-丁基-3-甲基咪唑，離子液體濃度為0.35 mol/L，料液比為1∶50，提取溶劑為40%乙醇水溶液，提取時間為3 h，提取溫度為65 ℃。

2.3　離子液體輔助提取香葉總黃酮的工藝穩(wěn)定性驗證試驗

取香葉粗粉3份，每份4 g，放入圓底燒瓶中，加入200 mL濃度為0.35 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的40%乙醇水溶液，水浴溫度控制在65 ℃，提取時間為3.0 h，其他操作同2.1.1節(jié)。結果香葉總黃酮提取率分別為109.37，111.77，108.23 mg/g，平均為109.79 mg/g，結果表明優(yōu)選的香葉總黃酮離子液體超聲輔助提取工藝比較穩(wěn)定。

2.4　香葉總黃酮提取的對比試驗

2.4.1離子液體對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉3份，每份4 g，放入圓底燒瓶中，加入200 mL的40%乙醇水溶液，水浴溫度控制在65 ℃，提取時間為3.0 h，其他操作同2.1.1節(jié)。結果香葉總黃酮提取率分別為80.61，81.54，80.17 mg/g，平均為80.77 mg/g。根據(jù)2.3節(jié)試驗結果可知，離子液體的加入使香葉總黃酮提取率提高了35.93%。

2.4.2酶對總黃酮提取率的影響

取香葉粗粉3份，每份4 g，放入圓底燒瓶中，加入200 mL濃度為0.35 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的40%乙醇水溶液，然后再加入纖維素酶0.02 g，水浴溫度控制在65 ℃，提取時間為3.0 h，其他操作同2.1.1節(jié)，提取結束后在90 ℃水浴中30 s滅酶。結果香葉總黃酮提取率分別為116.52，117.63，118.31 mg/g，平均為117.49 mg/g。由試驗結果可知，體系中加入了纖維素酶使香葉總黃酮提取率進一步提高，可能是因為纖維素酶破壞了香葉的細胞壁，從而使細胞內(nèi)的香葉總黃酮溶出增加，從而提高了總黃酮提取率。

2.4.3脫脂對總黃酮提取率的影響

取干燥的香葉粉10 g，加入50 mL石油醚回流脫脂2次，每次1 h，過濾，濾渣于60 ℃以下干燥至干，取脫脂后的香葉粗粉3份，每份4 g，放入圓底燒瓶中，然后按2.3節(jié)方法進行試驗。結果香葉總黃酮提取率分別為114.66，113.95，114.08 mg/g，平均為114.23 mg/g。由試驗結果可知，脫脂后除去了香葉中的葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性物質，結果使香葉總黃酮提取率有所提高，但提高幅度低于纖維素酶。

2.5　體外抗氧化性研究

稱取香葉干浸膏適量，用50%乙醇水溶液制備成不同質量濃度的一系列樣品溶液。在10個10 mL比色管中分別加入2.0 mL上述一系列樣品溶液，然后再加入濃度為0.2 mmol/L 的DPPH·溶液2.0 mL，混合均勻，在室溫條件下暗處放置30 min，用50%的乙醇水溶液為空白對照，于517 nm波長處測定吸光度A樣品。其他條件不變，用2.0 mL蒸餾水代替測定A樣品中的香葉樣品液，其他操作同上，在517 nm處測定吸光度A空白。在10個10 mL比色管中分別加入2.0 mL上述一系列樣品溶液，然后再加入無水乙醇2.0 mL，混合均勻，其他操作同上，在517 nm處測定吸光度A對照。

稱取維生素C適量，制備成一系列與樣品溶液質量濃度相同的對照溶液，按照上述方法同樣操作。通過下式分別計算香葉樣品溶液、維生素C對照溶液對DPPH·的清除率[13]。

DPPH·清除率(%)=[(A空白-A樣品+A對照)/A空白]×100。

圖6　樣品溶液和對照溶液對DPPH·的清除活性Fig.6 The scavenging activity of sample solution and reference solution to DPPH·

由圖6可知，隨著香葉提取物與維生素C溶液質量濃度的增加，其對DPPH·的清除率均逐漸升高，二者對DPPH·的清除能力均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，在質量濃度小于0.4 mg/mL時香葉提取物的清除能力低于維生素C；當質量濃度高于0.4 mg/mL時香葉提取物的清除能力與維生素C接近；當質量濃度為0.5 mg/mL時二者對DPPH·的清除率分別為98.92%，99.07%。香葉提取物對DPPH·的清除率與質量濃度的線性回歸方程為Y=2.9413+199.4206X，R=0.9903，香葉提取物對DPPH·的清除率的IC50值為0.2360 mg/mL；而維生素C的質量濃度與對DPPH·的清除率的線性回歸方程為Y=21.6433+166.5879X，R=0.9861，其IC50值為0.1702 mg/mL。結果表明香葉提取物對DPPH·的清除能力弱于陽性對照維生素C，但其清除率與質量濃度的線性回歸性強于陽性對照維生素C。

3　結論

本試驗對離子液體超聲輔助提取香葉總黃酮的工藝條件進行了探索，并采用單因素及正交試驗對其進行了優(yōu)化。比較適宜的提取工藝條件為：提取溶劑為40%乙醇，料液比為1∶50，水浴溫度控制在65 ℃，提取時間為3.0 h，最佳離子液體為氯化-1-丁基-3-甲基咪唑，離子液體濃度為0.35 mol/L，超聲波頻率設定為90 W，在此工藝條件下，香葉總黃酮提取率為109.79 mg/g。本文采用的離子液體超聲輔助提取法，其提取率高，與傳統(tǒng)超聲輔助醇提工藝相比，總黃酮提取率提高了35.93%，說明離子液體超聲輔助提取法是一種高效的提取方法。可能是因為將離子液體用作溶劑時，超聲的空化效應能加速離子液體穿透香葉組織細胞，促進香葉組織內(nèi)的黃酮類物質溶出，而且離子液體可能對香葉總黃酮具有一定的增溶作用，同時離子液體可能作為一種轉運載體將黃酮類物質從香葉細胞內(nèi)運出，增大了其溶出率，從而提高了香葉總黃酮提取率。本文進一步探索了在提取體系中加入纖維素酶對提取率的影響，試驗結果表明由于纖維素酶破壞了香葉的細胞壁，從而使細胞內(nèi)的黃酮類物質最大限度地溶出，因此可進一步地提高總黃酮提取率，與傳統(tǒng)超聲輔助醇提工藝相比，總黃酮提取率提高了45.46%。體外抗氧化活性的試驗結果表明：香葉提取物對DPPH·具有顯著的清除活性，而且隨著其質量濃度的增加，清除活性明顯增強，其IC50值為0.2360 mg/mL。上述試驗結果為香葉在食品、飲料、制藥等領域的應用提供了基礎。

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