秦南南，夏俊芳，沈玉敏，牛晴偉，古麗娜孜，程怡媚

(新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院,烏魯木齊　830052)

釀造醬油主要是用黃豆、小麥作為主要原料，經多種微生物(曲霉、酵母菌和細菌)的聯合作用，釀制而成的一種受人們歡迎的調味品，內含氨基酸、糖類、維生素等多種營養(yǎng)物質[1]。這些營養(yǎng)易被多種微生物利用尤其夏季氣溫高的時候極易發(fā)生脹袋，發(fā)生產氣滲漏現象給產品造成巨大影響。針對上述出現脹袋現象的樣品，本研究從新疆某品牌脹袋醬油中篩選出兩株能引起脹袋的產氣菌株，通過形態(tài)學、生理生化、分子生物學手段對其進行種屬鑒定，并對菌株的溫度、酸堿性、鹽度特性進行研究，分析熱殺菌時間、防腐劑對產氣微生物生長的影響，以期為脹袋醬油中產氣菌的研究奠定一定的基礎。

1　材料與方法

1.1　主要材料與儀器

1.1.1試驗材料

新疆某醬油企業(yè)提供的脹袋醬油、正常醬油。

1.1.2試驗試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基：購于北京奧博星生物技術有限公司；山梨酸鉀、苯甲酸鈉、氯化鈉等(均為分析純)：購于天津市盛淼精細化工有限公司；革蘭氏染色劑、孔雀綠染色劑：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心。

1.1.3試驗儀器

LRH-280 型生化培養(yǎng)箱上海森信試驗儀器有限公司；LDZX-40SCI 型高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；722 可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司；FE20 plus pH計上海梅特勒-托利多儀器有限公司； DJ100-3 型電子分析天平上海恒平科學儀器有限公司；Nikon E200光學生物顯微鏡北京瑞科中儀科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1多種培養(yǎng)基分離微生物

無菌條件下將正常醬油和脹袋醬油吸取25 mL于225 mL無菌生理鹽水中，振搖5～10 min制備菌懸液，在無菌條件下準確吸取不同濃度梯度的菌液0.1 mL，涂布于多種培養(yǎng)基(高糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)表面，同時做空白對照，細菌37 ℃培養(yǎng)，酵母菌、霉菌28 ℃培養(yǎng)，連續(xù)2～5天觀察，對比脹袋醬油與正常醬油中分離出來的菌落形態(tài)，將形態(tài)不同、懷疑是產氣微生物的菌株進行劃線分離、純化，保存菌株備用。

1.2.2產氣微生物的驗證

將可疑微生物分別接種到相應的產氣驗證培養(yǎng)基(選用最貼近醬油營養(yǎng)條件的培養(yǎng)基，醬油原油50 mL，蒸餾水50 mL，pH 5.5，加入杜氏管,115 ℃滅菌20 min)[2]。無菌條件下向滅菌后的產氣驗證培養(yǎng)基管中加入1 mL的菌懸液，若為細菌，置于37 ℃培養(yǎng)，若為霉菌和酵母菌，置于28 ℃培養(yǎng),連續(xù)觀察1～14天，觀察小導管中是否有氣泡生成，同時用生理鹽水做空白對照，若小導管中有氣泡生成，再從產氣的試管中分離其中的微生物觀察其性狀并與接種的菌落形態(tài)對比，觀察是否相同。

1.2.3產氣微生物的鑒定

1.2.3.1菌株形態(tài)及生理生化鑒定

將驗證的產氣細菌進行菌落特征、菌體形態(tài)(革蘭氏染色、芽孢染色)和生理生化實驗，參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[3，4]。對于霉菌和酵母，也通過觀察菌落形態(tài)、菌體形態(tài)及生理生化，參考《真菌鑒定手冊》來鑒定其株屬[5]。

1.2.3.216S rDNA分子生物學鑒定

采用細菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，對產氣菌株的16S rDNA進行PCR擴增，產物經瓊脂糖電泳分離后DNA回收試劑盒割膠回收和純化，將PCR產物送金唯智生物科技有限公司進行測序，將得到的16S rDNA序列在NCBI-GenBank進行BLAST分析,找到序列最相近的微生物種類,其相似度達96%以上認為是同一種菌[6-8]。

1.2.4產氣微生物的耐溫性、耐鹽性、耐pH的特性分析

將產氣菌接種到LB肉湯管中，并使接種后菌濃度達到108cfu/mL，測定在不同溫度(4，10，25，30，35，40，45 ℃)、不同鹽濃度(0%，3%，5%，7%，9%，11%，13%，15%，17%，19%，21%)及不同初始 pH 值(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，8.0)下的生長情況，平行3次并設置空白對照管，測定菌液的OD600 nm值。

1.2.5熱殺菌時間對產氣微生物生長的影響

將產氣菌接種到LB肉湯管中，接種后菌濃度達到108cfu/mL。對菌株選用85 ℃和100 ℃的處理溫度，處理時間：0，5，10，15，20，25，30 min，LB肉湯于37 ℃培養(yǎng)24 h，每個處理3個平行并設置空白對照，測定菌液的OD600 nm值。

1.2.6防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀對產氣微生物生長的影響

GB 2760-2014食品安全國家標準《食品添加劑使用標準》規(guī)定苯甲酸鈉和山梨酸鉀在醬油中的最大使用量是1.0 g/kg，分別設置濃度為0，0.1，0.3，0.5，0.7，1.0 g/kg梯度防腐劑濃度，將制備好的菌懸液接種到含有不同濃度防腐劑的LB肉湯試管中，以接菌但不含防腐劑為對照組，LB肉湯于37 ℃培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600 nm值(每個處理3個平行并設置空白對照)。然后選擇合適的防腐劑濃度水平，根據下列公式計算抑菌率：

IR(%)=(k0-k)/k0×100。

式中:IR為抑菌率(%)；k0為不添加防腐劑對照組的菌落數(cfu/mL)；k為添加防腐劑的菌落數(cfu/mL)。

1.2.7模擬殺菌方案對比

準備數支10 mL正常醬油經過121 ℃滅菌30 min確定無菌，人為接種1環(huán)產氣菌株單菌落，設計4組試驗：先加入終濃度為0.7 g/kg的苯甲酸鈉再于85 ℃滅菌15 min；先加入終濃度為0.7 g/kg的山梨酸鉀再于85 ℃滅菌15 min；先于85 ℃滅菌15 min再加入終濃度為0.7 g/kg的苯甲酸鈉；先于85 ℃滅菌15 min再加入終濃度為0.7 g/kg的山梨酸鉀，分別在37，4 ℃培養(yǎng)后采用涂布平板法計算菌落數，平行測定3次取其平均值，以無菌水為空白對照。

2　結果

2.1　多種培養(yǎng)基分離微生物

本實驗沒有分離出酵母菌和霉菌，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離脹袋醬油K1和正常醬油K2時，可以看到細菌數目有明顯差異(見圖1)，對比K1，K2分離平板，根據細菌菌落形態(tài)的不同，共分離、純化出 4株細菌菌株，編號為Z1，Z2，Z3，Z4，并于 4 ℃冰箱中用營養(yǎng)瓊脂斜面保藏備用，結果見圖2，菌落特征見表1。

圖1　K1和K2樣品營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離結果Fig.1 Nutrient AGAR separation results of sample K1 and K2

圖2　Z1,Z2,Z3,Z4菌株營養(yǎng)瓊脂分離結果Fig.2 Nutrient AGAR separation results of sample Z1, Z2, Z3 and Z4 strains

表1　Z1，Z2，Z3，Z4菌株菌落特征Table 1 Colony characteristics of Z1, Z2, Z3 and Z4 strains

2.2　產生驗證結果觀察

表2　產氣驗證實驗結果Table 2 Results of gas production verification

續(xù)　表

注：“-”代表無產氣現象，“+-”代表微弱產氣，“+”代表有明顯產氣，“+”的個數越多代表產氣越明顯。

由表2可知，接種脹袋醬油樣品的3支試管在觀察期(1～14天)都有產氣現象，且隨著天數增多，產氣現象越明顯；接種Z2，Z3 的試管，在觀察期(14天)中未看到產氣現象；接種Z1，Z4 的試管，接種1天后試管產氣，隨著天數增多，產氣現象加強；將產氣管中的微生物分離于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與接種菌株對比，發(fā)現菌落形態(tài)一致。由此可見，菌株Z1，Z4為導致醬油脹袋的產氣微生物，產氣現象見圖3。

圖3　菌株的產氣實驗結果Fig.3 The gas production results of strains

2.3　產氣微生物的鑒定

2.3.1傳統(tǒng)鑒定結果

2.3.1.1菌株形態(tài)觀察

圖4　Z1菌株在營養(yǎng)瓊脂(A)和LB液體培養(yǎng)基(B)及革蘭氏染色形態(tài)(C)和芽孢染色結果(D)Fig.4 Morphology of Z1 strain on NA(A),LB liquid medium(B), Gram staining (C) and spore staining(D)

圖5　Z4菌株在營養(yǎng)瓊脂(A)和LB液體培養(yǎng)基(B)及革蘭氏染色形態(tài)(C)和芽孢染色結果(D)Fig.5 Morphology of Z4 strain on NA(A),LB liquid medium(B),Gram staining (C) and spore staining(D)

由圖4和圖5可知，Z1，Z4菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的菌落形態(tài)見表1，Z1菌株呈不規(guī)則圓形性狀，同心環(huán)膜狀，表面質地干燥褶皺，乳白色，底部濕潤，無光澤，不透明，Z4菌株呈不規(guī)則圓形形狀，鋸齒狀邊緣，乳白色，中間凸起，質地較為粘稠且松軟，不透明；LB肉湯培養(yǎng)液輕微渾濁，表面有完整菌膜，菌膜呈灰白色；通過革蘭氏染色、芽孢染色等結果得出2株菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。

2.3.1.2菌株生理生化特性

產氣菌株糖醇發(fā)酵實驗結果見表3， Z1菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇并且產酸，Vp反應陰性，明膠液化快，酪素分解迅速，分解硝酸鹽。Z4菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖等多種糖、醇產酸，分解硝酸鹽、水解淀粉。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定Z1菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，Z4菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

表3　兩株菌株生理生化特性Table 3 Biochemical characteristics of two strains

續(xù)　表

注：“+”為陽性反應，“-”為陰性反應，“+-”為弱陽性。

2.3.216S rDNA鑒定結果

PCR擴增獲得約1500 bp目標產區(qū)(見圖6)， Z1菌株的16S rDNA序列長度為1420 bp，Z4菌株的16S rDNA序列長度為1415 bp，將得到的序列上傳至NCBI-GenBank，進行BLAST同源性檢索分析。由表4可知，Z1菌株的16S rDNA與Bacillusmegateriumstrain H3-2菌株的該基因序列的匹配度為1.00，且序列長度最接近，與2.3.1傳統(tǒng)方法鑒定的結果一致，故Z1菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。由表5可知，Z4菌株的16S rDNA與Bacillussubtilisstrain BS-5菌株的該基因序列的匹配度為1.00，且序列長度最接近，與2.3.1傳統(tǒng)方法鑒定結果一致，所以Z4菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖6　菌株的16S rDNA擴增電泳結果Fig.6 The results of strains' 16S rDNA electrophoresis

注：M表示Maker；1，2,3分別是Z1菌株、Z4菌株、陰性質控。

表4　Z1菌株16S rDNA的BLAST結果Table 4 The BLAST results of 16S rDNA of Z1 strain

表5　Z4菌株16S rDNA的BLAST結果Table 5 The BLAST results of 16S rDNA of Z4 strain

2.4　產氣微生物的耐溫性、耐鹽性、耐pH的特性分析

2.4.1溫度對產氣菌生長的影響

圖7　溫度對Z1，Z4 2株菌生長的影響Fig.7 The effect of temperature on the growth of Z1 and Z4 strains

由圖7可知，在4，10 ℃培養(yǎng)時，Z1和Z4培養(yǎng)液吸光值幾乎為0，說明該溫度下菌株生長能力很弱，當在10～30 ℃時，隨著溫度的升高，Z1，Z4 2株菌快速生長，最適生長溫度為36～38 ℃，溫度高于40 ℃時，2株菌生長速率減緩但仍能生長，且吸光值均在0.2以上，表明2株菌具有較強耐溫性。

2.4.2鹽度對產氣菌株生長的影響

Z1，Z4 2株菌在含不同鹽度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，測得的菌液OD600 nm的變化值見圖8，整體來看，隨著氯化鈉含量的增加，吸光值逐漸下降，氯化鈉含量5%時生長狀況較好，Z1，Z4吸光值分別為0.233，0.245，說明2株菌在一定氯化鈉濃度范圍內，有利于菌體生長，隨著鹽度的升高，菌體生長能力逐漸減弱，但在15%～21%鹽度范圍內，菌體仍能緩慢生長，而正常醬油鹽含量一般是15%左右，表明2株產氣菌有較強耐鹽性，可以在醬油環(huán)境中存活下來。

圖8　鹽度對Z1，Z4 2株菌生長的影響Fig.8 The effect of salinity on the growth of Z1 and Z4 strains

2.4.3pH對產氣菌株生長的影響

圖9　pH對Z1，Z4 2株菌生長的影響Fig.9 The effect of pH on the growth of Z1 and Z4 strains

圖10　pH對Z1，Z4 2株菌菌膜形成的影響Fig.10 The effect of pH on the formation of Z1 and Z4 strains' biofilms

由圖9，圖10可知，在pH 3.5～5.0范圍內，Z1，Z4 2株菌生長緩慢，菌液澄清且沒有形成菌膜， pH在5.0～7.0時，菌株生長能力隨著pH的增大而增大，當pH>5.5時，培養(yǎng)液渾濁且形成菌膜，Z1，Z4 2株菌均在pH值為7.0時有最大吸收值，隨著pH>7.0時，菌液OD值逐漸下降，可見2株菌均適合在略酸、偏中性環(huán)境下生長，正常醬油pH范圍為4.5～5.5，此酸度也適于產氣菌株的生長，隨著產氣菌的生長繁殖新陳代謝，醬油酸度逐漸會增加，引起醬油腐敗變質。

2.5　熱殺菌時間對產氣微生物生長的影響

圖11　100 ℃和85 ℃高溫處理不同時間對Z1，Z42株菌生長的影響Fig.11 The effect of heat treatment at different time at 100 ℃ and 85 ℃ on the growth of Z1 and Z4 strains

由圖11可知，85 ℃對Z1，Z4菌株的處理時間為15 min，菌液濃度變化不大；處理時間由15 min增加到30 min時，菌液濃度下降，但吸光值仍在0.2以上，且隨著滅菌時間的延長，菌濃度又開始上升(25～30 min)，可能是因為Z1和Z4菌株的耐熱性都較強，當處理溫度較低時仍有耐熱菌存活，溫度適宜又重新繁殖生長。100 ℃時，隨著處理時間的增長，菌液吸光值也隨之下降，處理25 min時2菌株吸光值幾乎接近于0。可見采用85 ℃很難將菌株殺死，采用100 ℃的溫度殺菌時至少要處理25 min，才能將Z1，Z4滅活。

2.6　防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀對產氣微生物生長的影響

2種防腐劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀)對Z1，Z4 2株菌株生長的影響，見圖12。隨著防腐劑濃度的增大，對菌株的抑菌效果也逐漸增強，0.7 g/kg時幾乎已觀察不到菌膜，對于Z1菌株，0.7 g/kg苯甲酸鈉的抑菌效果高于同濃度山梨酸鉀9.7%，對于Z4菌株，0.7 g/kg苯甲酸鈉的抑菌效果高于同濃度山梨酸鉀16.25%，所以苯甲酸鈉的抑菌效果要明顯優(yōu)于山梨酸鉀的抑菌效果。由于醬油中添加防腐劑的含量不得超過1 g/kg，從安全角度考慮，我們選用0.7 g/kg為最佳濃度，計算抑菌率，苯甲酸鈉對2株菌的抑菌率都在99%以上，見表6。

圖12　不同濃度防腐劑對Z1，Z4 2株菌生長的影響Fig.12 The effect of different concentration of preservatives on the growth of two strains

表6　0.7 g/kg防腐劑濃度對Z1，Z42株菌生長的影響Table 6 The effect of 0.7 g/kg concentration of preservatives on the growth of two strains

2.7　模擬殺菌方案確定

考慮醬油營養(yǎng)價值，設計4組殺菌試驗，結果見表7，表明一旦樣品中污染Z1，Z4菌株，結合采用防腐劑和巴氏滅菌并不能完全殺滅，但采用先滅菌再接入防腐劑的方式可以將危害盡可能降低到最低水平，其中苯甲酸鈉抑菌效果優(yōu)于山梨酸鉀。

表7　模擬殺菌試驗結果Table 7 Test results of bactericidal simulation

3　討論

在本研究中我們采用平板分離、產氣驗證、生理生化及分子生物學鑒定出引起醬油漲袋的產氣微生物為巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，2株菌在環(huán)境中非常常見，雖不是致病菌但生化實驗表明2株菌能發(fā)酵多種糖類產酸產氣，若殘存在醬油產品中，在夏季氣溫高時必引起脹袋，張小麗等[9]從浙江紹興某廠脹袋醬油中也分離出巨大芽孢桿菌，可見東西地域相差如此遠卻分離出一致的產氣菌株，必須嚴格控制將其殺滅。同時對2株菌溫度、耐鹽性及其pH等特性研究，成品醬油普通滅菌很難殺死菌株，本研究采用熱處理、防腐輔助結合抑制芽孢桿菌，發(fā)現滅菌后添加防腐劑有較好抑菌作用且苯甲酸鈉抑菌效果優(yōu)于山梨酸鉀，可以將危害盡可能降低到最低水平，但要想在源頭上去除產氣菌對醬油生產的危害，只有加強工廠生產環(huán)境，對生產的各個環(huán)節(jié)進行監(jiān)控，避免二次污染。

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