李黎洪　徐巧莉　陳智偉　陳　昱　吳麗婷　胡建雄

(莆田學院附屬醫(yī)院乳腺外科，福建　莆田　351100)

1莆田學院附屬醫(yī)院綜合病房2莆田學院附屬醫(yī)院病理科

3莆田學院附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護室

據(jù)報道，乳腺癌發(fā)病率和死亡率逐年上升，發(fā)病率約為女性惡性腫瘤的29%〔1〕，年齡的增加、酗酒、吸煙、肥胖等均可導致乳腺癌的發(fā)生。目前，乳腺癌的診斷和治療方法取得了一系列的發(fā)展，但其五年生存率仍較低〔1～3〕。乳腺癌的發(fā)病機制并不完全清楚。研究表明，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展受多種細胞因子、分子信號通路的影響〔4〕。經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細胞增殖、分化等，對癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程起重要作用。Wnt1是一類Wnt基因的總稱，對結(jié)構(gòu)相似的分泌性信號轉(zhuǎn)導蛋白具有編碼作用。既往研究表明，大部分Wnt基因在乳腺癌組織中的表達量增加，促進下游靶基因的表達，參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展〔5〕。本研究通過小RNA特異性調(diào)節(jié)Wnt1基因表達，研究下調(diào)Wnt1基因水平對乳腺癌細胞侵襲、遷移的影響及對Wnt1/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器人乳腺癌細胞系MCF-7購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基 、胎牛血清購自美國Sigma公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Wnt1抗體、β-catenin抗體、細胞周期素(cyclin)-D1購自美國Abcam公司，β-肌動蛋白(actin)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗購自南京碧云天生物科技有限公司，恒溫培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，臺式高速(低溫)離心機、凝膠成像儀購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2細胞培養(yǎng)將凍存MCF-7細胞置于37℃水浴鍋中迅速溶化，轉(zhuǎn)入6孔細胞培養(yǎng)板中，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的新鮮培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞匯合度達80%～90%，加入胰酶消化細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打，制成新的細胞懸浮液，離心，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.3細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h，細胞接種于24孔板中，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到50%以上，加入Opti-MEM I培養(yǎng)基，分別將Lipofectamine 2000和siRNA-陰性對照(NC)或siRNA-Wnt1稀釋為5 μl/孔、1.25 μl/孔，室溫孵育20 min，將復合物加入24孔板中，混勻，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，更換為生長培養(yǎng)基，48 h后進行其他實驗。實驗分為對照組，shRNA-NC組，shRNA-Wnt1組，免疫印跡實驗(Western印跡)觀察轉(zhuǎn)染后細胞中Wnt1蛋白的表達量。

1.4細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力提前在6孔細胞培養(yǎng)板背后均勻劃線；將轉(zhuǎn)染后的細胞以8×104個/孔接種于6孔板中，在5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使用無菌的10 μl槍頭在細胞表面劃線，盡量垂直于培養(yǎng)板背后的線條，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入無血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用Image J軟件分析劃痕面積。

1.5Transwell法檢測細胞侵襲能力實驗前，采用無血清的培養(yǎng)基按1∶8的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠(50 mg/L)，包被Transwell小室基底膜的上室面，4℃通風6 h,細胞提前饑餓12～24 h，胰酶消化轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，以8×104個細胞接種到Transwell小室上室中，下室中加入600 μl含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，避免產(chǎn)生氣泡，將小室放入24孔板中，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，棉簽輕輕拭去上室中未通過濾膜的細胞，甲醇固定下室細胞10 min，結(jié)晶紫染色2 min，在倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，每組5個復孔，實驗重復3次。

1.6Western印跡檢測細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白的表達水平棄去培養(yǎng)基，預冷的PBS清洗細胞，加入預冷的細胞RIPA裂解液，在冰上放置30 min，細胞刮板收集細胞，12 000 r/min離心半徑7.0 cm，10 min，取上清，BCA法蛋白定量。取30 μg蛋白與4倍上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min。將提前配置的PAGE膠固定于電泳槽中，加入樣品蛋白，80 V電泳20 min，當溴酚藍遷移至濃縮膠與分離膠界面處，調(diào)整電壓至130 V，電泳1 h，待溴酚藍電泳至凝膠底部，切斷電源，將電泳凝膠所攜帶的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，TBST漂洗硝酸纖維素膜，加入10 ml 5%脫脂牛奶封閉，4℃過夜，加入適量稀釋的一抗，37℃結(jié)合1～2 h。TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，加入適量比例稀釋二抗，37℃結(jié)合1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。顯色5 min，曝光30～60 s，顯影2 min，定影1 min，沖洗晾干，以β-actin為對照，凝膠成像儀檢測目的蛋白灰度值。

1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS21.0軟件，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本差異使用LSD-t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1檢測細胞轉(zhuǎn)染效果與對照組(Wnt1/β-actin:0.865±0.074)相比，shRNA-NC組細胞中Wnt1蛋白(0.883±0.092)的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但shRNA-Wnt1組細胞中Wnt1蛋白(0.421±0.065)的表達量顯著降低(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt1小干擾RNA可使MCF-7細胞表達的Wnt1蛋白減少。見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染后細胞中Wnt1蛋白的表達量

2.2下調(diào)Wnt1基因表達對細胞侵襲能力的影響與對照組相比，shRNA-NC組細胞侵襲數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，shRNA-Wnt1組細胞侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)，表明下調(diào)MCF-7細胞表達的Wnt1可降低細胞的侵襲能力。見表1。

2.3下調(diào)Wnt1基因表達對細胞遷移能力的影響與對照組相比，shRNA-NC組細胞的劃痕面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，shRNA-Wnt1組細胞的劃痕面積顯著減少(P<0.05)，表明下調(diào)乳腺癌MCF-7細胞中Wnt1基因的表達量可降低細胞的遷移能力。見表1。

表1　下調(diào)Wnt1基因表達對細胞侵襲能力和遷移能力的影響

與對照組相比：1)P<0.05，下表同

2.4下調(diào)Wnt1基因表達對細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白表達量的影響與對照組相比，siRNA-NC轉(zhuǎn)染MCF-7細胞系后，β-catenin、cyclin-D1蛋白的表達量沒有明顯變化；siRNA-Wnt1轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后，β-catenin、cyclin-D1蛋白的表達量明顯下調(diào)(P<0.05)，表明下調(diào)Wnt1基因表達可有效降低乳腺癌細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白水平。見表2，圖2。

圖2　下調(diào)Wnt1基因表達對細胞中β-catenin、cyclin-D1蛋白表達量的影響

組別β?catenin/β?actincyclin?D1/β?actin對照組0468±00620787±0075shRNA?NC組0452±00570792±0083shRNA?Wnt1組0215±00231)0326±00681)

3　討　論

乳腺癌常見的治療的方法有藥物治療、手術(shù)、放療等，其中手術(shù)為主要的治療方法。但因乳腺癌的生長方式具有侵襲和浸潤能力，早期極容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此不能采用手術(shù)全切的方法，目前多以綜合治療手段為主〔6，7〕。乳腺癌具有侵襲、遷移的生物學特性，是其容易產(chǎn)生局部或者遠端轉(zhuǎn)移并發(fā)生惡性浸潤生長的主要原因〔8〕。在乳腺癌的治療中，抑制細胞的侵襲、遷移能力十分重要，對控制乳腺癌的發(fā)展和提高5年生存率、改善預后有著重要的意義。本文結(jié)果提示W(wǎng)nt1有望成為新的乳腺癌治療的靶點。

Wnt1是最早被發(fā)現(xiàn)的Wnt家族的成員之一，是Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路中的重要信號傳遞因子〔9〕。當機體發(fā)生病理性異常時，Wnt1被激活，破壞β-catenin結(jié)合E鈣黏附蛋白和細胞骨架蛋白等多蛋白復合物，使得細胞質(zhì)中的非磷酸化β-catenin水平增多，進入細胞核，從而激活Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因(cyclin-D1等)，調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔10〕。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路是經(jīng)典的Wnt信號通路。研究表明Wnt1在乳腺癌組織中的表達量顯著高于正常乳腺組織，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔11〕。抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路的活化誘導乳腺上皮細胞惡性增殖，促進腫瘤的發(fā)生〔12，13〕。報道證明抑制Wnt1基因的表達可誘導乳腺癌細胞凋亡〔14〕。但目前關(guān)于Wnt1信號通路對乳腺癌侵襲、遷移的作用機制的相關(guān)報道較少，本研究結(jié)果提示下調(diào)Wnt1基因水平可能通過抑制Wnt1/β-catenin信號通路介導的下游靶基因的水平，降低乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力。

綜上所述，siRNA Wnt1可特異性降低乳腺癌細胞中Wnt1基因的表達量，抑制Wnt1/β-catenin信號通路介導的下游靶基因cyclin-D1的水平，從而下調(diào)乳腺癌細胞的侵襲、遷移能力，為乳腺癌的臨床診斷和治療提供新的分子靶點，具有一定的現(xiàn)實意義。

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