柴　瑛　

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，黑龍江　佳木斯　154002)

骨肉瘤是起源于間葉組織，主要發(fā)生于長骨的干骺端，具有惡性度高、易于轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，生存期短及病死率高等特點(diǎn)〔1〕。含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的去整合素樣金屬蛋白酶(ADAMTS)18基因?qū)儆贏DAMTS 家族成員，可表達(dá)調(diào)控多種疾病過程的一種金屬蛋白酶。在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)ADAMTS18基因啟動子高甲基化失活和低表達(dá)，而活化ADAMTS18基因可對腫瘤的增殖和侵襲起到抑制作用，故它被認(rèn)為是一種抑癌基因〔2，3〕。本實(shí)驗(yàn)通過研究過表達(dá)ADAMTS18基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖與遷移的作用及其機(jī)制，以明確該基因在骨肉瘤中的生物學(xué)功能和潛在的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、材料及試劑143B和U-20S人骨肉瘤細(xì)胞(美國菌種保藏中心)；RPMI1640、DMEM E培養(yǎng)液及胰蛋白酶(Hyclone)；胎牛血清 (FBS，Gibco)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；遺傳霉素(G418，Sigma)；青、鏈霉素(碧云天生物)；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8，博士德)；細(xì)胞遷移小室(Transwell小室，Corning)；兔抗人ADAMTS18多克隆抗體(Abcam)；兔抗人蛋白激酶B(AKT)單克隆抗體(CST)；鼠抗人 β-actin 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(中杉金橋)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)143B細(xì)胞和U-20S細(xì)胞所用培養(yǎng)基分別為含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM和RPMI1640，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

1.3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期的143B和U-20S 細(xì)胞分別培養(yǎng)于6孔板中(2×105個/孔)；待細(xì)胞生長融合度達(dá)到70%以上時，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將ADAMTS18表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染入兩株細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用含400 μg/ml G418 的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；Western印跡實(shí)驗(yàn)鑒定陽性克隆。

1.4增殖實(shí)驗(yàn)將空載體轉(zhuǎn)染的143B細(xì)胞株(V-143B)、過表達(dá)ADAMTS18基因的143B細(xì)胞株(A-143B)、空載體轉(zhuǎn)染的U-20S細(xì)胞株(V-U-20S)、過表達(dá)ADAMTS18基因的U-20S細(xì)胞株(A-U-20S)制備單細(xì)胞懸液并接種于96孔板中(3×103/孔)；分別在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48和72 h，向孔板中加入CCK-8試劑(10 μl/孔，每株細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度(OD)值。

1.5遷移實(shí)驗(yàn)分別將100 μl不含F(xiàn)BS的V-143B、A-143B、V-U-20S和A-U-20S細(xì)胞懸液(1.5×105個/ ml)滴加入Transwell上室，24孔板下室中為600 μl含10% FBS培養(yǎng)基；分別在細(xì)胞培養(yǎng)的24、48 h，用棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)表面以去除未穿越細(xì)胞，甲醇-結(jié)晶紫固定染色后計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6Western印跡40 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜，4%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，分別用ADAMTS18抗體(1∶1 000)、AKT抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 000)4℃反應(yīng)過夜；洗膜后用山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)37℃孵育45 min；洗膜、顯色、拍照后，以β-actin光密度值為內(nèi)參照，測算各蛋白相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0軟件行t、q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1過表達(dá)細(xì)胞的鑒定V-143B、V-U-20S、A-143B和A-U-20S細(xì)胞ADAMTS18相對表達(dá)量分別為(0.253 8±0.095 5)、(0.527 8±0.126 9)、(1.378 6±0.123 2)和(1.577 4±0.179 8)。兩株細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株與各自空載體轉(zhuǎn)染株差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.2ADAMTS18下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)量V-143B、V-U-20S、A-143B和A-U-20S細(xì)胞AKT相對表達(dá)量分別為(1.261 2±0.087 5)、(1.524 4±0.197 5)、(0.527 8±0.077 1)和(0.354 2±0.090 4)。與各自空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株比較，兩株細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株AKT相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。見圖1。

2.3ADAMTS18抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h，A-143B細(xì)胞OD值顯著低于V-143B(P<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h，A-U-20S細(xì)胞OD值顯著低于V-U-20S(P<0.05)。見表1。

2.4ADAMTS18抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移細(xì)胞培養(yǎng)48 h，A-143B細(xì)胞遷移數(shù)量值顯著低于V-143B(P<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h，A-U-20S細(xì)胞遷移數(shù)量值顯著低于V-U-20S(P<0.05；P<0.01)。見表2。

圖1　Western印跡檢測ADAMTS18和AKT基因的表達(dá)

組別24h48h72hV?143B05165±0063908625±0039413485±00784A?143B04993±0057807843±007411)12387±003891)V?U?20S04095±0064006625±0044710665±01002A?U?20S03408±003751)05978±003812)09348±004642)

與V-143B比較：1)P<0.05,與V-U-20S比較：2)P<0.05

表2　過表達(dá)ADAMTS18抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移

與V-143B比較：1)P<0.05；與V-U-20S比較：2)P<0.05,3)P<0.01

3　討　論

ADAMTSs可參與組織發(fā)育、重建、炎癥反應(yīng)、癌癥和血管生成等多種生物學(xué)過程〔4〕。ADAMTSs金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解，生長因子、細(xì)胞因子和黏附分子的釋放、脫落，并進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和血管生成〔5〕。由于之前對ADAMTS18功能和底物知之甚少，故ADAMTS18一度被認(rèn)為是ADAMTSs 家族的“孤兒”。研究報道，在胃癌、結(jié)直腸、胰腺和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中，均可發(fā)現(xiàn)ADAMTS18高甲基化失活或表達(dá)下調(diào)〔6，7〕。黏附因子β-鏈蛋白及其下游靶基因細(xì)胞周期蛋白D1、原癌基因異常激活在腫瘤發(fā)生中具有重要作用〔8〕，Lu等〔4〕報道，在小鼠模型中ADAMTS18表達(dá)缺乏經(jīng)上調(diào)β-catenin表達(dá)和活化p38MAPK/ERK1/2信號促進(jìn)結(jié)腸致癌作用。本研究證實(shí)上調(diào)ADAMTS18表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型、下調(diào)AKT蛋白水平；與Xu等〔2〕在乳腺癌中的結(jié)研究果相一致，由此可見，下調(diào)AKT通路活性亦是ADAMTS18抑制腫瘤惡性表型的一種可能機(jī)制。

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015;65(2)：87-108.

2Xu H，Xiao Q，F(xiàn)an Y，etal.Epigenetic silencing of ADAMTS18 promotes cell migration and invasion of breast cancer through AKT and NF-κB signaling〔J〕.Cancer Med,2017;6(6)：1399-408.

3徐紅英，肖茜，范宇，等.ADAMTS18基因過表達(dá)可抑制人乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲〔J〕.腫瘤，2016;36(7)：749-57.

4Lu T，Dang S，Zhu R，etal.ADAMTS18 deficiency promotes colon carcinogenesis by enhancing β-catenin and p38MAPK/ERK1/2 signaling in the mouse model of AOM/DSS-induced colitis-associated colorectal cancer〔J〕.Oncotarget，2017;8(12)：18979-90.

5Rocks N，Paulissen G，El Hour M，etal.Emerging roles of ADAM and ADAMTS metalloproteinases in cancer〔J〕.Biochimie，2008;90(2)：369-79.

6Li L，Tao Q，Jin H，etal.The tumor suppressor UCHL1 forms a complex with p53/MDM2/ARF to promote p53 signaling and is frequently silenced in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2010;16(11)：2949-58.

7Xu B，Zhang L，Luo C，etal.Hypermethylation of the 16q23.1 tumor suppressor gene ADAMTS18 in clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Int J Mol Sci，2015;16(1)：1051-65.

8Vermeulen L，De Sousa E，Melo F，etal.Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironmen〔J〕.Nat Cell Biol，2010;12(5)：468-76.