林培珺　王　鵬　陳　靜　向東方　毛高峰　

(武漢市精神衛(wèi)生中心抑郁病房，湖北　武漢　430000)

1解放軍161醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

微小RNA(miRNAs)在進(jìn)化上高度保守，且不編碼蛋白，可通過與其特異性的靶mRNA結(jié)合，降解或抑制蛋白的翻譯，從而對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控〔1〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有多種miRNA表達(dá)，且一些miRNA特異性在腦組織的各個亞區(qū)表達(dá)〔2〕。大量研究顯示，特異性的miRNA影響神經(jīng)系統(tǒng)樹突生長、神經(jīng)發(fā)生、樹突棘形態(tài)等生理過程〔3～5〕。miR-183基因簇存在于多數(shù)的后口動物中，是一個高度保守的基因簇，有研究顯示，在人和小鼠的大腦皮質(zhì)中有miR-183的特異性表達(dá)，參與大腦皮層發(fā)育及神經(jīng)細(xì)胞分化的調(diào)控，但miR-183對學(xué)習(xí)記憶的影響研究尚不清楚〔6〕。本研究在小鼠大腦海馬齒狀回注射miR-183的抑制試劑鎖核酸(LNA)-miR-183，Morris水迷宮檢測小鼠的行為學(xué)變化，并檢測記憶相關(guān)蛋白突觸后致密蛋白(PSD95)、NR2B、NR1的蛋白表達(dá)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器Trizol購自美國Invitrogen；熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takala；LNA抑制探針購自美國EXIQON；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Morris 水迷宮及記錄儀購自中國泰盟；腦立體定位儀購自中國瑞沃德。

1.2實驗動物C57/BL Wild-Type 2月齡雄性小鼠由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至3～4月齡用于實驗研究。飼養(yǎng)期間每籠限制個數(shù)，按照12 h的黑暗交替規(guī)律作息。采取自由飲水和采食。動物處理按照1995年神經(jīng)科學(xué)協(xié)會的《動物使用政策》的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3miR-183在小鼠海馬中的表達(dá)冰上分離雙側(cè)海馬，大約25 mg，Trizol法提取海馬中的總RNA，紫外分光光度計根據(jù)OD260 nm/280 nm值確定RNA的純度和濃度，取2 μg的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，以cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參基因，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測miR-183的mRNA表達(dá)。利用2-△△Ct法對各樣品的Ct值進(jìn)行基因的表達(dá)分析。

1.4抑制miR-183后小鼠的行為變化水迷宮實驗檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。首先采用立體定位技術(shù)在小鼠大腦海馬齒狀回注射miR-183的抑制試劑LNA-miR-183，同時設(shè)置生理鹽水為陰性對照及無關(guān)對照LNA-Scramble，72 h后檢測相應(yīng)的行為學(xué)變化。

1.5Western印跡脫臼處死小鼠，分離出全腦，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌腦表面的血跡，置于冰上小平皿上快速分離出雙側(cè)的海馬，放入已干凈的離心管中，勻漿離心后取上清，BCA法測定蛋白的濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶10比例充分混勻，置于100℃煮沸變性10 min，取等量蛋白樣品依次進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、聚偏氟乙稀(PVDF)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，分別加入PSD95、NR2B、NR1(均按照1∶500稀釋)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1∶1 000稀釋)一抗，4℃過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌(3次×10 min)，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色，顯影后采用Gel-Pro analyzer分析各個條帶的光密度，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，分析PSD95、NR2B、NR1的蛋白相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1海馬和皮質(zhì)中miR-183的表達(dá)小鼠海馬和皮質(zhì)中miR-183 mRNA表達(dá)(0.71±0.08，0.62±0.06)均顯著低于對照組(1.00±0.05，P<0.01)。

2.2抑制內(nèi)源性miR-183對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響對照組、LNA-Scramble組和LNA-miR-183組在1 d的潛伏期分別為(79.2±0.07)、(78.2±0.11)、(77.1±0.26)s，2 d的潛伏期分別為(58.8±2.69)、(56.8±2.83)、(61.2±3.23)s，3 d的潛伏期分別為(46.2±3.21)、(46.0±3.45)、(48.9±3.11)s，4 d的潛伏期分別為(42.1±4.12)、(41.5±4.09)、(44.6±4.03)s，5 d的潛伏期分別為(38.8±4.06)、(37.2±3.98)、(46.8±3.46)s，6 d的潛伏期分別為(24.3±3.21)、(26.8±3.18)、(42.9±3.65)s，平臺通過次數(shù)分別為(4.1±0.43)、(4.3±0.41)、(1.9±0.32)次，與對照組比較，LNA-miR-183組小鼠訓(xùn)練階段的潛伏期延長，記憶檢測階段時穿越平臺位置的次數(shù)也明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3抑制內(nèi)源性miR-183對PSD95、NR2B、NR1蛋白表達(dá)的影響對照組、LNA-Scramble組和LNA-miR-183組PSD95的蛋白表達(dá)分別為(0.514±0.042)、(0.507±0.041)、(0.161±0.024)，NR2B的蛋白表達(dá)分別為(0.142±0.019)、(0.148±0.020)、(0.091±0.012)，NR1的蛋白表達(dá)分別為(0.358±0.032)、(0.361±0.033)、(0.082±0.011)，LNA-miR-183組均顯著低于對照組(P<0.01)。見圖1。

圖1　抑制內(nèi)源性miR-183對PSD95、NR2B、NR1蛋白表達(dá)的影響

3　討　論

目前已發(fā)現(xiàn)多種表達(dá)異常的miRNA可能與學(xué)習(xí)記憶的發(fā)生有關(guān)〔7〕。有研究顯示，miR-183可參與帕金森病的發(fā)生〔8〕。關(guān)于miR-183基因?qū)W(xué)習(xí)記憶的影響尚不清楚。

Morris水迷宮是檢測海馬依賴最經(jīng)典的方法。PSD95是在谷氨酰胺能突觸后的致密區(qū)中發(fā)現(xiàn)的特殊蛋白質(zhì)，可參與突觸鏈接的維持和形成，在整合和介導(dǎo)N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究顯示，PSD95基因的敲除可引起小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及長時程增強(qiáng)的改變〔9〕。NMDA受體由NR(1～3)3種亞甲基組成，NR2又分為NR2A、NR2B、NR2C、NR2D，NR2B是NMDA受體發(fā)揮作用不可缺少的亞基之一，被稱為“聰明的基因”，可以多種方式影響學(xué)習(xí)記憶和突觸的可塑性〔10〕。本研究結(jié)果提示，抑制內(nèi)源性miR-183表達(dá)可損傷學(xué)習(xí)記憶能力，可能與PSD95、NR2B、NR1的蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

1Eichhorn SW,Guo H,McGeary SE,etal.mRNA destabilization is the dominant effect of mammalian microRNAs by the time substantial repression ensues〔J〕.Mol Cell,2014;56(1):104-15.

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3Cheng TL,Wang Z,Liao Q,etal.MeCP2 suppresses nuclear microRNA processing and dendritic growth by regulating the DGCR8/Drosha complex〔J〕.Dev Cell,2014;28(5):547-60.

4呂路,梅蕊,彭樊,等.Akt信號通路在非典型性抗精神病藥物阿立哌唑調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2017;37(9):2110-2.

5Bicker S,Khudayberdiev S,Weib K,etal.The DEAH-box helicase DHX36 mediates dendritic localization of the neuronal precursor-microRNA-134〔J〕.Genes Dev,2013;27(9):991-6.

6McSweeney KM,Gussow AB,Bradrick SS,etal.Inhibition of microRNA 128 promotes excitability of cultured cortical neuronal networks〔J〕.Genome Res,2016;26(10):1411-6.

7Williamson VS,Mamdani M,McMichael GO,etal.Expression quantitative trait loci (eQTLs) in microRNA genes are enriched for schizophrenia and bipolar disorder association signals〔J〕.Psychol Med,2015;45(12):2557-69.

8Alsharafi W,Xiao B.Dynamic expression of microRNAs (183,135a,125b,128,30c and 27a) in the rat pilocarpine model and temporal lobe epilepsy patients〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targ,2015;14(8):1096-102.

9Takei Y,Kikkawa YS,Atapour N,etal.Defects in synaptic plasticity,reduced NMDA-receptor transport,and instability of postsynaptic density proteins in mice lacking microtubule-associated protein 1A〔J〕.J Neurosci,2015;35(47):15539-54.

10MacDougall G,Anderton RS,Edwards AB,etal.The neuroprotective peptide poly-arginine-12 (R12) reduces cell surface levels of NMDA NR2B receptor subunit in cortical neurons;investigation into the involvement of endocytic mechanisms〔J〕.J Mol Neurosci,2017;61(2):235-46.