黃　俊　張明霞　吳均芳　陳云肖　姜　紅

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西　南昌　330006)

心肌纖維化是糖尿病重要并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制并未完全闡明〔1〕。miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一類來源于內(nèi)源性染色體的非編碼單鏈RNA，可對目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。miRNA在心肌組織有特征性表達(dá)，在調(diào)控心肌細(xì)胞的分化發(fā)育，在眾多心臟病變的病理生理過程中起著重要作用〔2，3〕。本文擬建立1型糖尿病大鼠心肌纖維化模型，運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測心肌組織中miRNA差異表達(dá)，初步探討miRNA在1型糖尿病心肌纖維化病理過程中的作用。

1　材料與方法

1.1動物、分組、主要試劑和儀器30只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(170±5.85)g；隨機(jī)分為糖尿病模型組和對照組各15只。實(shí)驗(yàn)動物按南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會規(guī)定執(zhí)行。鏈脲佐菌素(STZ)，TRIzol試劑(Sigma，美國)；血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀，美國)；GE VIVI7超聲診斷系統(tǒng)(探頭頻率12 MHz，美國GE)；第六代miRCURY TM LNA Array (v.16.0，Exiqon)；熒光標(biāo)記、芯片雜交及結(jié)果檢測在上?？党缮锕緦?shí)驗(yàn)室完成；奧林巴斯BX51顯微鏡。

1.2方法

1.2.1建立糖尿病心肌纖維化大鼠模型參考相關(guān)文獻(xiàn)〔4〕，模型組大鼠經(jīng)單次腹腔注射STZ(60 mg/kg)制作1型糖尿病動物模型。對照組大鼠則單次腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。STZ注射后72 h，尾靜脈采血檢測隨機(jī)血糖，模型組剔除血糖低于16.7 mmol/L大鼠。成模后每周測量實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、血糖1次，血糖高于16.7 mmol/L即認(rèn)為模型建立成功。

1.2.2心臟功能檢測建模后12 w超聲心動圖檢測，大鼠麻醉固定仰臥略向左傾斜位后獲取胸骨旁左室長軸切面二維及M型超聲圖像，測量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，左室壁厚度(LVWT)，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室短軸縮短率(FS)。

1.2.3心肌VG染色組織學(xué)檢查建模后12 w麻醉、處死大鼠，取左心室心肌組織，10%磷酸鹽緩沖液(PBS)中性甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，VG染色觀察心肌組織膠原含量變化，Image-Pro Plus4.0圖像系統(tǒng)測量心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF，膠原面積/總面積)。

1.2.4心肌組織miRNA表達(dá)檢測芯片檢測差異表達(dá)miRNA，TRIzol試劑抽提大鼠心肌組織總 RNA，分光光度計(jì)定量，甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。分離<100 nt的小分子RNA，miRCURY TM Hy3 TM螢光標(biāo)記，采用第6代 miRCURY TM LNA Array芯片(包含1 891個成熟miRNA探針，包括miRBase 16.0中所有人類、大鼠和小鼠microRNAs，及與之相關(guān)的所有病毒microRNAs，包含66個新的miRPlus TM人類microRNAs探針)進(jìn)行基因芯片雜交，Axon GenePix 4000B microarray 掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 6.0 software軟件對芯片圖像分析。

1.2.5差異miRNA靶基因預(yù)測及功能分析采用生物信息學(xué)分析方法，運(yùn)用 miRBase和starBase分析軟件進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs的靶標(biāo)基因預(yù)測和功能分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS7.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1兩組生存率、血糖、心臟功能及心肌組織學(xué)改變模型組與對照組大鼠生存率分別為93.3%和100.0%；模型組大鼠血糖均>16.7 mmol/L，對照組為5.6～7.4 mmol/L。超聲檢測模型組大鼠LVWT、LVEDD和LVESD明顯大于對照組；LVEF和左心室FS明顯小于對照組(均P<0.05)，見表1。心肌VG染色模型組粉紅色膠原組織增多，對照組黃色心肌組織內(nèi)僅有少許粉紅色膠原組織表達(dá)；膠原半定量分析對照組CVF〔(1.93±0.45)%〕明顯少于模型組〔(8.35±1.02)%,P<0.05〕。

表1　兩組心臟指標(biāo)比較

與對照組比較：1)P<0.05

2.2miRNA芯片檢測見表2，表3。芯片檢測結(jié)果顯示，12 w模型大鼠心肌組織62個miRNAs表達(dá)有明顯差異，其中上調(diào)miRNAs 38個，下調(diào)miRNAs 24個(表達(dá)差異標(biāo)準(zhǔn)以上下1.5倍作為域值范圍)，差異倍數(shù)改變大于2倍的miRNA共有25個。

表2　模型組上調(diào)miRNAs

2.3miRNAs靶基因預(yù)測應(yīng)用生物信息學(xué)方法對目前已建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫，差異表達(dá)≥2倍的miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測，基因主要涉及細(xì)胞生長、膠原纖維生長、凋亡、血管生成、細(xì)胞分化與增殖等生物學(xué)功能，見表4。

表3　模型組下調(diào)miRNAs

表4　差異表達(dá)miRNAs的主要靶基因及其功能

3　討　論

miRNA為19～22個核苷酸的非編碼小調(diào)控RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體RNA經(jīng)Dicer酶加工生成，通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)序列的堿基配對，指導(dǎo)效應(yīng)復(fù)合物RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，通過mRNA 降解和翻譯抑制兩種不同機(jī)制，調(diào)控靶基因表達(dá)。miRNA參與包括細(xì)胞分裂增殖、分化發(fā)育及代謝等許多重要的生物學(xué)過程，一種miRNA可能調(diào)控多種甚至數(shù)百種蛋白質(zhì)的翻譯過程，多個miRNA也可能作用于同一種mRNA〔2〕。糖尿病患者外周血采用miRNA 芯片技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)特異性miRNA表達(dá)變化，提示某些miRNA參與了糖尿病的病理生理過程〔4〕。目前有關(guān)miRNA 在糖尿病腎病纖維化中的作用研究較多〔5〕，miRNA377在STZ誘導(dǎo)的小鼠糖尿病腎病模型、高糖及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1共培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞中表達(dá)均上升，腎系膜細(xì)胞過表達(dá)miRNA377 能增加纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成〔6〕。

本文糖尿病大鼠成模12 w后，心臟功能減退、心室擴(kuò)張，心肌組織內(nèi)膠原含量增多，心肌纖維化明顯，為1型糖尿病大鼠心肌纖維化心肌組織miRNA表達(dá)譜的研究提供了一個可靠的模型，與對照組比較心肌組織差異表達(dá)2倍以上的miRNA有25個，其中hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-208a、hsa-miR-150-5p在心臟發(fā)育、血管生成及心臟病理過程中有重要調(diào)控作用。

miR-29在心臟成纖維細(xì)胞中比在心肌細(xì)胞中表達(dá)得更多，但miR-29在梗死心臟的邊界區(qū)表達(dá)下調(diào)。然而這種對立的調(diào)節(jié)通過膠原蛋白和彈性蛋白的合成依然與心肌纖維化相關(guān)〔3〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠心肌組織miR-29a/b/c表達(dá)上調(diào)，但對于高糖是否直接通過miR-29影響心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化及miR-29所調(diào)控的確切靶基因尚需進(jìn)一步確認(rèn)。

MiR-208a是目前發(fā)現(xiàn)的另一種與心肌肥大和纖維化相關(guān)的miRNA。通過轉(zhuǎn)基因在小鼠心臟中過表達(dá)miR-208a可引起心肌肥大。上調(diào)miR-208a可能通過顯著抑制靶基因甲狀腺素相關(guān)蛋白和肌肉抑制素這兩種肌肉生長和肥大的負(fù)性調(diào)節(jié)者，從而導(dǎo)致心肌肥大、纖維化和心力衰竭〔7〕。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病模型大鼠心肌組織miR-208a表達(dá)上調(diào)，但對于高糖是否直接通過miR-208a影響心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化及miR-208a所調(diào)控的確切靶基因尚需進(jìn)一步確認(rèn)。

循環(huán)miR-126減少在非糖尿病人群被發(fā)現(xiàn)是一個重要的糖尿病預(yù)測因子，從正常葡萄糖耐受，到糖耐量減低，再到糖尿病，miR-126的血漿水平逐漸下降〔8〕。本研究糖尿病模型大鼠心肌組織miR-126表達(dá)也顯著下調(diào)，但miR-126與糖尿病大鼠心肌纖維化是否有關(guān)目前不知。我們前期實(shí)驗(yàn)在STZ制作的1型糖尿病大鼠心肌纖維化模型中，發(fā)現(xiàn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD31、α-SMA，證實(shí)微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，通過該途徑生成大量的成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞在心肌纖維化中發(fā)揮作用〔9〕。本實(shí)驗(yàn)中miR-328在糖尿病大鼠心肌纖維化中的表達(dá)上升4倍。研究發(fā)現(xiàn)房顫患者血清miR-328濃度明顯高于正常對照，與房顫持續(xù)時(shí)間及左心房直徑相關(guān)〔10〕。miR-328還可通過靶基因CD44調(diào)節(jié)小鼠腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象〔11〕。我們推測miR-328有可能調(diào)節(jié)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，在1型糖尿病大鼠心肌纖維化中發(fā)揮作用。 本研究利用miRBase和starBase分析軟件，對差異表達(dá)的miRNA可能調(diào)控的靶基因進(jìn)行初步預(yù)測，這些基因主要涉及細(xì)胞生長、膠原纖維生長、凋亡、血管生成、細(xì)胞分化與增殖等生物學(xué)功能。然而仍有大量預(yù)測靶基因及其功能需要實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，且一種miRNA可同時(shí)調(diào)節(jié)多個靶基因表達(dá)，一個靶基因又同時(shí)受多種miRNA的調(diào)控，提示miRNA參與和調(diào)控生物學(xué)功能的多樣性和復(fù)雜性。本研究僅提示miRNAs可能涉及糖尿病心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程，但對于差異表達(dá)的miRNAs如何啟動糖尿病心肌纖維化發(fā)生機(jī)制的問題尚有待深入研究和探討。

1Maya L，Villarreal FJ.Diagnostic approaches for diabetic cardiomyopathy and myocardial fibrosis〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2010；48(3)：524-9.

2Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004；116(2)：281-97.

3E van Rooij，Sutherland LB，Thatcher JE，etal.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.PNAS，2008；105(35)：13027-32.

4Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，etal.Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes〔J〕.Circ Res，2010；107(6)：810-7.

5Kato M，Natarajan R.microRNA cascade in diabetic kidney disease：big impact initiated by a small RNA〔J〕.Cell Cycle，2009；8(22)：3613-4.

6Wang Q，Wang Y，Minto AW，etal.MicroRNA-377 is up-regulated and can lead to increased fibronectin production in diabetic nephropathy〔J〕.FASEB J，2008；22(12)：4126-35.

7Callis TE，Pandya K，Seok HY，etal.MicroRNA208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice〔J〕.J Clin Invest，2009；119(9)：2772-86.

8Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，etal.Plasma micro-RNA proling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes〔J〕.Circ Res，2010；107(6)：810-7.

9黃俊，張明霞，黃江燕，等.1型糖尿病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的鑒定〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(23)：6653-6.

10McManus DD，Lin H，Tanriverdi K，etal.Relations between circulating microRNAs and atrial fibrillation：data from the Framingham Offspring Study〔J〕.Heart Rhythm，2014；11(4)：663-9.

11Chen CH，Cheng CY，Chen YC，etal.MicroRNA-328 inhibits renal tubular cell epithelial-to-mesenchymal transition by targeting the CD44 in pressure-induced renal fibrosis〔J〕，PLoS One，2014；9(6)：e99802.