郭勝男　叢培瑋　王艷杰　王德山　

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，遼寧　沈陽　110847)

脾氣虛本質(zhì)一直是中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的一個(gè)重要部分，其機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)內(nèi)分泌的軸調(diào)節(jié)、免疫功能、消化功能和能量代謝等方面。基礎(chǔ)理論表明，心與脾臟的關(guān)系主要表現(xiàn)在血液生成與血液運(yùn)行兩個(gè)方面的相互協(xié)同功能。脾主運(yùn)化，運(yùn)輸水谷精微向上達(dá)肺臟，復(fù)注于心脈赤化生成血；而心主一身之血，又能滋養(yǎng)脾臟，供給其正常的功能行使。研究表明心肌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)1對心臟正常生理功能有重要作用，水通道蛋白(AQP)1可能在病理情況致心肌細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變而發(fā)揮重要作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過檢測脾氣虛模型大鼠心肌細(xì)胞中GLUT1和AQP1的表達(dá)水平，探討脾氣虛中脾與心生理功能關(guān)系的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物本溪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級雄性SD大鼠16只，許可證號：SCXK(遼)(2010-001)，體重(200±10)g，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑和儀器RT-PCR反應(yīng)試劑盒(Takara公司)；二喹啉甲酸(BAC)蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠AQP1、GLUT1抗體、羊抗兔IgG抗體(CST公司)；PCR反應(yīng)儀，7500 RT-PCR檢測儀，YLS-13A大小鼠抓力測定儀。

1.3建立脾氣虛模型大鼠被隨機(jī)分為對照和脾氣虛兩組。脾氣虛組模型建立和評價(jià)參考報(bào)道〔1〕。對照組：在同一溫度和濕度環(huán)境下飼養(yǎng)，不限制飲水及進(jìn)食。脾氣虛組：飼養(yǎng)1 w適應(yīng)后開始實(shí)驗(yàn)。第1天先過多喂食，接著連續(xù)2 d禁食處理，不限制飲水，重復(fù)操作5次；每日35℃～37℃常溫水中游泳至力竭。

1.4模型評價(jià)基本情況測量兩組大鼠體質(zhì)量、體溫，計(jì)算24 h進(jìn)食量；檢測大鼠肌力〔1〕。

1.5RT-PCR法檢測AQP1、GLUT1 mRNA表達(dá)水平造模結(jié)束后取大鼠心臟組織，提取總RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物序列：AQP1：上游引物5′-GACTACACTGGCTGTGGGATCAA-3′，下游引物5′-CCAGGGCACTCCCAA TGAA-3′；GLUT1上游引物5′-TCCTGCTCATCAAT CGTAA-3′，下游引物5′-GACCCTCTTCTTTCATCTCC-3′。

1.6免疫印跡法測定AQP1、GLUT1蛋白表達(dá)水平取大鼠心臟組織，提取總蛋白，定量后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。80～120 V條件下電泳，100 V 80 min濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜，37℃室溫5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過夜孵育；二抗(1∶1 000)稀釋，室溫封閉1 h；最后，化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1模型評價(jià)與對照組比較，脾氣虛組被毛稀松，活動(dòng)減少，部分大鼠反應(yīng)遲鈍，對周圍刺激不敏感，大便稀軟甚至水樣；體溫、進(jìn)食量、前肢抓力均降低(P<0.05)，見表1。

表1　兩組體溫、進(jìn)食量及前肢抓力比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2AQP1、GLUT1 mRNA表達(dá)水平比較與對照組(設(shè)為1)比較，脾氣虛組AQP1和GLUT1 mRNA水平(0.55±0.13，0.44±0.14)明顯減少(P<0.01)。

2.3AQP1、GLUT1 蛋白表達(dá)水平比較與對照組比較，脾氣虛組AQP1和GLUT1表達(dá)明顯減少(P<0.01)，見圖1，表2。

圖1　心肌組織AQP1、GLUT1表達(dá)水平

組別AQP1GLUT1對照組01772±00060951414±00468脾氣虛組01457±00051202)1084±0021412)

3　討　論

本實(shí)驗(yàn)中脾氣虛模型沿用了實(shí)驗(yàn)組前期使用的造模法，即飲食失節(jié)結(jié)合勞倦過度兩種手段，結(jié)果顯示，脾氣虛組大鼠活動(dòng)明顯減少，喜懶乏力，皮毛蓬松無光澤，大便多不成形甚至泄瀉如水狀。與此一致的表現(xiàn)為大鼠體重量減輕，基礎(chǔ)體溫或有降低，進(jìn)食量明顯減少，前肢抓力降低。因此，認(rèn)為脾氣虛模型造模成功。

脾為氣血生化之源，薛氏滋化源認(rèn)為“滋化源者何？脾胃之氣是也。土為萬物之母，則萬物非土不生，唯脾土旺則萬物皆昌，而四臟多有生氣矣”。先天稟賦不足，飲食不節(jié)、水谷不化，氣血不足，都可能最終導(dǎo)致脾胃功能障礙，產(chǎn)生脾虛之癥候?！捌馓搫t四肢不用，五臟不安”，脾氣日益衰竭，血脈不通順，筋骨肌肉失去濡養(yǎng)，經(jīng)久失用，其他臟器同樣不能行使其功能，維持人體正常活動(dòng)。

目前對脾虛機(jī)制的研究主要集中在消化系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌軸、免疫調(diào)節(jié)和能量代謝等方面。文獻(xiàn)報(bào)道的能量代謝相關(guān)理論認(rèn)為，精微物質(zhì)(主要指三大物質(zhì)如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等)通過血液循環(huán)被輸送到各組織細(xì)胞，以酶促反應(yīng)完成能量轉(zhuǎn)化，最后產(chǎn)生ATP、H2O和CO2。

葡萄糖是生物體能量代謝的最重要來源之一，GLUTs是葡萄糖出入細(xì)胞的重要載體，作為第一個(gè)限速酶在糖代謝中具有積極意義。目前已知的GLUTs共有14種，GLUT1、GLUT3、GLUT4與葡萄糖親和力較高，其中GLUT1是最基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，與葡萄糖親和力最高。研究表明機(jī)體各組織內(nèi)通過調(diào)節(jié)GLUTs表達(dá)，形成代償性保護(hù)機(jī)制，即在高血糖狀態(tài)下，GLUTs水平反而降低，以此避免高血糖細(xì)胞毒性〔2〕。GLUT1和GLUT3在腦缺血、缺氧環(huán)境中表達(dá)明顯增加，尤其是GLUT1在2 h內(nèi)即可達(dá)到高峰。尚冰等〔3〕研究證實(shí)，脾氣虛大鼠模型中大腸組織的GLUT5表達(dá)水平明顯降低。叢培瑋等〔4〕研究認(rèn)為，中醫(yī)脾虛在臨床出現(xiàn)的消化功能紊亂可能由下丘腦調(diào)節(jié)功能異常引起，表現(xiàn)為下丘腦分泌β-EP、CCK、VIP明顯減少，表達(dá)GLUT1、GLUT3減少。

水的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)對生命活動(dòng)有絕對重要的意義。AQPs是一類能夠促進(jìn)水分子快速跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)的蛋白質(zhì)。目前，AQPs在肺、神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿生殖器官中已確切分布，對其作用機(jī)制的研究也較為清楚，但在心臟方面相關(guān)研究就顯得較少。文獻(xiàn)報(bào)道，AQP1在心肌組織中表達(dá)水平較高且與心肌水腫關(guān)系最為密切〔5〕。Butler等〔6〕利用AQPs敲除小鼠模型檢測AQPs在心肌細(xì)胞中相關(guān)作用，結(jié)果現(xiàn)實(shí)AQP1敲除小鼠水通透性下降最明顯，因此認(rèn)為AQP1在心肌細(xì)胞中起主要作用。Kellen等〔7〕研究認(rèn)為穩(wěn)定狀態(tài)下只有28%的水分子通過AQPs轉(zhuǎn)運(yùn)完成，而高滲狀態(tài)下的水分子可轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)正常的800倍，這種升高作用主要通過AQPs實(shí)現(xiàn)。李志清等〔8〕研究AQP1在大鼠燒傷早期心肌的表達(dá)及與心肌水腫的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)燒傷后心肌細(xì)胞AQP1表達(dá)增多與心肌水腫呈正相關(guān)，且通過抑制AQP1表達(dá)可減輕心肌水腫。因此，AQP1可能在病理情況致心肌細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變起重要作用。

心與脾的關(guān)系，主要體現(xiàn)為脾主運(yùn)化，使水谷精微向上輸布于肺，復(fù)注于心脈赤化生血；心主血脈，心血進(jìn)一步供養(yǎng)脾臟以維持正常的運(yùn)化功能，兩者在血液生成與運(yùn)行關(guān)系中相互協(xié)同互利。研究表明〔9〕，心肌缺血缺氧狀態(tài)，心肌細(xì)胞膜上GLUT1和GLUT4表達(dá)增多，目的是幫助更多的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)參與糖酵解過程，在滿足組織器官能量需求的同時(shí)保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。另一方面，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)異?？蓪?dǎo)致心肌功能異常。姜曉琳〔10〕研究認(rèn)為脾氣虛模型大鼠“脾主運(yùn)化”功能損傷時(shí)，其左室收縮末期容積增大，舒張末期容積、每搏出量等均發(fā)生變化，且左室射血分?jǐn)?shù)發(fā)生改變。脾氣虛運(yùn)化功能發(fā)生障礙，心臟射血功能異常，即表現(xiàn)為行血功能下降。本研究以脾氣虛為模型，發(fā)現(xiàn)脾氣虛組GLUT1水平明顯降低。因此，推斷脾氣虛表現(xiàn)的血液生成不足，不能榮養(yǎng)身體，可能與心臟組織GLUT1表達(dá)減少有關(guān)。

此外，心肌細(xì)胞中AQP1水平降低，其水轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低，但正常情況和病理情況下AQP的功能不一致。趙俊林等〔11〕關(guān)于體外循環(huán)肺損傷與AQP-1基因表達(dá)相關(guān)性的研究中，認(rèn)為AQP1對體外循環(huán)肺損傷間質(zhì)水腫的形成和吸收起重要作用，其作用機(jī)制可能與AQP1表達(dá)下降導(dǎo)致跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低有關(guān)。Tabbutt等〔12〕利用羊心肺轉(zhuǎn)流模型，發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)手術(shù)后再灌注6 h，肺組織AQP1表達(dá)上升，再灌注3 h則無明顯變化。Egan等〔13〕在體外循環(huán)動(dòng)物模型的研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞中AQP1表達(dá)較術(shù)前均有上調(diào)，且與心肌細(xì)胞水腫程度呈正相關(guān)。

綜上所述，AQP1在心肌細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中有重要作用，但其在組織損傷(水腫)、心肺體外循環(huán)之間的作用機(jī)制尚不明確。文獻(xiàn)表明AQPs在脾虛濕困型疾病模型中有差異表達(dá)〔14〕，表明脾氣虛癥中脾運(yùn)化水液機(jī)制在生物學(xué)基礎(chǔ)上可能與AQPs表達(dá)量有關(guān)。

1尚冰.脾氣虛證、脾陰虛證、脾陽虛證模型大鼠MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC、8-OHdG、端粒長度變化的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

2崔家鵬,李德新,朱愛松.脾氣虛證模型大鼠心臟、肝臟、 腦組織 MAPK活性變化及補(bǔ)脾氣方藥對其影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2005;23(5):819-21.

3尚冰,叢培瑋,王艷杰,等.脾氣虛和脾陽虛模型大鼠空腸組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體5表達(dá)水平變化的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué),2016;19(3):332-6.

4叢培瑋,尚冰,王艷杰,等.脾氣虛和脾陽虛模型大鼠腦腸肽與下丘腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體3表達(dá)水平變化的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué),2016;19(18):2201-5.

5閆玉梅,梅舉,孫錕,等.水通道蛋白-1及其在心臟中作用的研究進(jìn)展〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011;31(1):99-103.

6Butler TL,Au CG,Yang B,etal.Cardiac aquaproin expression in humans,rats,and mice〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006;291(2):705-13.

7Kellen MR,Bassingthwaighte JB.Transient transcapillary exchange of water driven by osmotic forces in the heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ PHysiol,2003;285(3):1317-31.

8李志清,肖德權(quán),王甲漢,等.大鼠燙傷早期心肌組織水通道蛋白1表達(dá)及其與心肌水腫的關(guān)系〔J〕.中華燒傷雜志,2013;29(3):245-8.

9黃慶先.血糖水平對糖尿病大鼠心肌GLUT1和GLUT4表達(dá)變化的影響〔D〕.濟(jì)南：山東大學(xué),2013.

10姜曉琳.脾氣虛證模型大鼠心功能變化及其機(jī)制的研究〔D〕.沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

11趙俊林,紀(jì)陰心.體外循環(huán)肺損傷與水通道蛋白1基因表達(dá)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床,2012;16(5):482-5.

12Tabbutt S,Nelson DP,Tsai N,etal.Induction of aquaporin-1 mRNA following cardiopulmonary bypass and reperfusion〔J〕.Mol Med,1997;3(9):600-9.

13Egan JR,Butler TL,Cole AD,etal.Myocardial ischwmia is more important than the effects of cardiopulmonary bypass on myocardial water handling and portoperative dusfunction:a pediatric animal model〔J〕.J Thorac Cardiovasc Surg,2008;136(5):1265-73.

14趙廣西.水通道蛋白3和8在消化系統(tǒng)的表達(dá)及其在炎癥性腸病動(dòng)物模型中的改變〔D〕.上海：復(fù)旦大學(xué),2014.