虎　力　溫佩彤　高　原　張偉波　徐　平　

(上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，上?！?01203)

衰老性肌萎縮(SA)，也稱增齡性骨骼肌萎縮，伴有骨骼肌質(zhì)量及力量下降，增加摔倒、骨折風(fēng)險(xiǎn)，危害老年人健康〔1〕。研究表明〔2〕，衰老骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的密度及再生能力下降能夠延長肌肉損傷的恢復(fù)。衰老過程中肌肉衛(wèi)星干細(xì)胞異常分化與纖維化和脂肪沉積有關(guān)〔3〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β是重要的促纖維化形成的細(xì)胞因子，對細(xì)胞分裂、增殖具有促進(jìn)或抑制的雙重作用〔4〕。研究表明，抗阻運(yùn)動(dòng)或長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)對預(yù)防SA有良好效果〔5〕。本研究探討運(yùn)動(dòng)對TGF-β/Smad信號通路的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組6月齡雄性SD大鼠，36只，體重(420±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將大鼠隨機(jī)分為18月齡空白(YC)組、18月齡運(yùn)動(dòng)(YE)組、20月齡空白(AC)組、20月齡運(yùn)動(dòng)(AE)組、22月齡空白(JC)組、22月齡運(yùn)動(dòng)(JE)組，每組各6只。

1.2動(dòng)物模型建立大鼠自6月齡起給予自由飲水和飲食，室溫(23±1)℃，相對濕度(50±5)%，光照明、暗各12 h。飼養(yǎng)至12月齡開始跑臺運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)前各組大鼠反應(yīng)良好，毛發(fā)光滑、色白，行動(dòng)敏捷。

1.3干預(yù)措施空白組：YC、AC、JC組為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)對照，不運(yùn)動(dòng)，只選擇與運(yùn)動(dòng)組相同的時(shí)間點(diǎn)練習(xí)抓取動(dòng)作。運(yùn)動(dòng)組：YE、AE、JE組采取運(yùn)動(dòng)干預(yù)，各組的運(yùn)動(dòng)周期為：YE 12～18個(gè)月，AE 12～20個(gè)月，JE 12～22個(gè)月。參照Bedford等〔6〕的運(yùn)動(dòng)方案，起始速度15 m/min，持續(xù)2 min×6次，兩次運(yùn)動(dòng)之間休息2 min，坡度均為0，隔日1次，3 w后休息1 w。

1.4標(biāo)本取材各組分別于處理因素結(jié)束，待大鼠休息24 h后，采用10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，迅速取比目魚肌、腓腸肌稱重，一部分用錫紙包裹標(biāo)記后立即置于液氮中，另取一部分置于4%多聚甲醛溶液制備石蠟切片。通過心臟取血采集全血5 ml，常溫靜置1 h，離心(3 000 r/min)15 min，分離上層血清，用于檢測丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。待所有標(biāo)本收集完成后立即置于-80℃超低溫冰箱備用。

1.5指標(biāo)檢測①每天觀察各組大鼠的飲食、毛發(fā)及精神活動(dòng)狀態(tài)，肌肉獲取前稱量體重，計(jì)算肌肉濕重與體重之比。②依據(jù)試劑盒說明(南京建成抗氧化檢測試劑盒)檢測血清SOD、MDA含量。③采用常規(guī)石蠟切片，對比目魚肌進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色；采用OLYMPUS CX21型光學(xué)顯微鏡觀察骨骼肌形態(tài)；采用Leica IM50 image manager V1.20分析軟件對切片進(jìn)行抓圖、存儲與分析。④采用常規(guī)Western印跡法檢測骨骼肌蛋白表達(dá)，包括：與骨骼肌纖維化相關(guān)的信號蛋白TGF-β/Smad2/p-Smad2/Smad3/p-Smad3；與骨骼肌降解相關(guān)的信號蛋白肌肉萎縮盒F蛋白(Atrogen)/肌肉特異性環(huán)指蛋白(MuRF)/肌肉生長抑制素蛋白(MSTN)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1行為學(xué)觀察YC及YE組已出現(xiàn)毛色發(fā)黃、脊背部體毛枯疏無光澤，且存在不同程度的脫毛現(xiàn)象，尾部有色素沉著，活動(dòng)相對減少，反應(yīng)較為遲鈍，但飲食尚積極，AC、AE、JC、JE組上述表現(xiàn)更為明顯。

2.2各組體重與濕重及血清SOD、MDA水平比較YE、AE組體重較YC、AC組均有所下降，但比目魚肌和腓腸肌的濕重及濕重/體重均有所增加，但只有AE組比目魚肌濕重/體重較AC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JE組大鼠體重及比目魚肌、腓腸肌的濕重及濕重/體重均較JC組增加更為明顯，但只有JE組腓腸肌濕重較JC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。YE與YC組、AE與AC組比較SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低(均P<0.05)；JE與JC組比較SOD水平有所增加，MDA水平有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組體重濕重及血清SOD、MDA值比較

與YC組比較：1)P<0.05，與AC組比較：2)P<0.05，與JC組比較：3)P<0.05；下表同

2.3各組比目魚肌形態(tài)比較YE組骨骼肌細(xì)胞排列整齊，大小均勻，細(xì)胞膜清晰，肌纖維排列整齊，YC組部分區(qū)域肌纖維排列較松散，肌纖維圓形化、肌細(xì)胞直徑大小不等，細(xì)胞外基質(zhì)增多；與AC組相比，AE組肌纖維排列較為緊密，圓形化肌纖維和細(xì)胞核中心化現(xiàn)象相對少見；JC組大部分區(qū)域肌纖維排列較松散，且肌纖維大小、形態(tài)差異較大，部分肌纖維邊界圓潤，出現(xiàn)較多圓形化的肌纖維；JE組肌纖維排列較JC組緊密，圓形化肌纖維和細(xì)胞核中心化現(xiàn)象存在。見圖1。

圖1　各組比目魚肌橫切面圖(HE，×400)

2.4各組TGF-β/Smad通路信號蛋白表達(dá)情況比較與YC相比，YE組Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3表達(dá)均增加，但只有Smad2、Smad3水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與AC組相比，AE組上述信號蛋白表達(dá)均有所下降，但只有Smad2水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與JC組比較，JE組Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3水平均顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2　各組TGF-β/Smad通路信號蛋白表達(dá)情況

組別Smad2p?Smad2Smad3p?Smad3YC組0．68±0．280．71±0．060．45±0．090．61±0．12YE組0．99±0．221)0．72±0．120．64±0．161)0．70±0．10AC組0．41±0．280．85±0．270．55±0．130．70±0．20AE組0．25±0．152)0．72±0．300．40±0．140．53±0．14JC組0．81±0．121．11±0．171．06±0．351．86±0．82JE組0．73±0．373)0．89±0．193)0．74±0．533)1．49±0．643)

2.5各組骨髓肌降解相關(guān)信號蛋白表達(dá)情況比較YE組TGF、MSTN、Atrogen、MuRF水平均較YC組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AE組較AC組上述指標(biāo)均下降，但只有MSTN、Atrogen差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JE組上述指標(biāo)均較JC組顯著下降(均P<0.05)。見圖3、表3。

圖3　各組骨骼肌降解相關(guān)信號蛋白表達(dá)

組別TGFMSTNAtrogenMuRFYC組0．41±0．180．64±0．010．63±0．330．44±0．16YE組0．61±0．310．71±0．130．80±0．420．65±0．2AC組0．31±0．220．56±0．120．55±0．150．65±0．13AE組0．29±0．250．46±0．090．42±0．212)0．39±0．092)JC組1．26±0．471．70±0．041．26±0．561．41±0．26JE組0．89±0．483)0．96±0．253)0．67±0．193)1．18±0．413)

3　討　論

SOD是體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，MDA是細(xì)胞自由基損傷程度的指標(biāo)之一〔7〕，本研究提示運(yùn)動(dòng)減緩SA與調(diào)節(jié)機(jī)體氧自由基代謝有關(guān)。并且運(yùn)動(dòng)能夠延緩增齡所致的大鼠骨骼肌衰老的進(jìn)程。

研究表明，衰老過程伴隨骨骼肌纖維化加重〔4〕，骨骼肌纖維化的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)的過度集聚，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的纖維化從而形成機(jī)械屏障，阻礙細(xì)胞的遷移和融合，干擾肌纖維的再生〔8〕，而TGF-β是重要的促纖維化形成的細(xì)胞因子。研究表明〔9〕，骨骼肌纖維化是骨骼肌慢性疾病和外傷的病理性標(biāo)志之一，大量的肌纖維化會(huì)干擾肌纖維的再生及收縮功能的恢復(fù)。MSTN對骨骼肌的發(fā)育和再生具有明顯的負(fù)性調(diào)節(jié)作用〔10〕，本研究提示運(yùn)動(dòng)后期(20～22月齡)能夠降低骨骼肌的纖維化。

運(yùn)動(dòng)干預(yù)前期(12～18月齡)骨骼肌的纖維化相對增加，而運(yùn)動(dòng)后期(20～22月齡)骨骼肌纖維化程度又相對降低，并伴有骨骼肌質(zhì)量的顯著增加，可能原因?yàn)檎９趋兰≈亓康木S持需要蛋白合成與降解之間的平衡，肌萎縮最終都會(huì)導(dǎo)致蛋白含量的改變，而蛋白質(zhì)合成減少和(或)分解增加是導(dǎo)致骨骼肌重量減少的重要原因〔11〕。研究表明〔12〕，骨骼肌在萎縮狀態(tài)下泛素蛋白酶通路被激活。骨骼肌蛋白降解主要包括溶酶體、泛素-蛋白酶體(UPS)和Ca2+依賴性3種途徑。其中，UPS途徑是生物體最主要的蛋白降解系統(tǒng)，主要由泛素、泛素相關(guān)酶和蛋白酶體3部分組成，在多種蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮著重要作用，并具有高度的特異性。在肌萎縮時(shí)Atrogen-1和MuRF-1蛋白顯著激活〔12〕，而Atrogen-l、MuRF-1這兩個(gè)基因與骨骼肌蛋白降解密切相關(guān)，被認(rèn)為是與骨骼肌蛋白降解有關(guān)的特異性基因〔12〕。研究表明〔13〕，被動(dòng)運(yùn)動(dòng)能夠明顯降低失神經(jīng)骨骼肌萎縮中MuRF-1蛋白和mRNA表達(dá)水平。耐力訓(xùn)練和抗阻訓(xùn)練后，大鼠腓腸肌MuRF-1、Atrogen和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA表達(dá)顯著降低〔14〕。由此推斷，運(yùn)動(dòng)減緩SA的進(jìn)程，可能與運(yùn)動(dòng)干預(yù)后期降低骨骼肌纖維化和(或)降低骨骼肌蛋白降解有關(guān)。

綜上所述，本研究從骨骼肌纖維化及骨骼肌蛋白降解的角度，探討了運(yùn)動(dòng)減緩不同月齡增齡性SD大鼠骨骼肌萎縮的作用及其分子機(jī)制，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)能夠減緩SA的進(jìn)程，其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)后期降低骨骼肌的纖維化和(或)減少骨骼肌蛋白降解有關(guān)。

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