李桂花　夏　歡　楊新玲　

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)中心，新疆　烏魯木齊　830000)

1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

研究認(rèn)為，基因突變不僅是家族性帕金森病(FPD)的致病因素，在散發(fā)性帕金森病(SPD)患者中也可出現(xiàn)致病基因的突變〔1〕。研究也證實(shí)帕金森病(PD)相關(guān)基因的基因多態(tài)性與SPD患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)〔2〕。ATP13A2基因目前研究認(rèn)為是PD發(fā)病的易感致病基因，在早發(fā)性PD(EOPD)和FPD 患者中均可發(fā)現(xiàn) ATP13A2 基因突變〔3〕。Ala1144Thr位點(diǎn)目前是ATP13A2基因研究最新的位點(diǎn)之一，但目前尚缺乏相關(guān)研究報(bào)道。新疆地處中亞，世代居住于該地區(qū)的維吾爾族(簡(jiǎn)稱維族)相比漢族具有遺傳背景的差異性，故該研究在本課題組前期工作的基礎(chǔ)上，探討ATP13A2基因位點(diǎn)Ala1144Thr位點(diǎn)突變及多態(tài)性與新疆地區(qū)維吾爾族和漢族人群SPD發(fā)病(尤其是早發(fā)性)的相關(guān)性。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2012年8月至2015年3月收集來自于新疆伊犁地區(qū)、和田地區(qū)、烏魯木齊市流行病學(xué)調(diào)查及就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的長(zhǎng)期生活在新疆地區(qū)(2代以上)、未與其他民族通婚的維族及漢族原發(fā)性PD患者，正常對(duì)照組為同期流調(diào)中及來自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的生活環(huán)境、飲食習(xí)慣和受教育程度與PD患者相似，性別、族別相同，年齡相差不超過5歲，且家族中無PD家族史的健康體檢者。PD組420例，男245例，女175例；維族200例，漢族220例；以50歲為界分為EOPD組和遲發(fā)性PD(LOPD)組，EOPD組101例，LOPD組319例；正常對(duì)照組400例，男208例，女192例；維族198例，漢族202例；≤50歲者110例；>50歲者290例。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血2 ml置于含800 μl乙二醇四乙酸的抗凝管中，使用天根生化(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒配套說明操作書操作。檢驗(yàn)DNA純度在1.7～1.9，濃度≥10 ng/Bul,判為DNA純度合格。樣本-20℃保存，備用。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)由上海生工公司合成，Ala1144Thr位點(diǎn)：上游引物：5′-GCAGGGAGTTCCAGTGTCTG-3′。下游引物：5′-GGTCTGGTCACCCTCAACTTC-3′；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系共20 μl:2×Qat PCR Master Mix 10 μl,10 μmol/ml上下游引物各0.5 μl,100 ng/μl DNA 2 μl,去離子水補(bǔ)至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，經(jīng)過25個(gè)循環(huán)(94℃變性30 s，60.3℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸7 min，保存于4℃，PCR產(chǎn)物為323 bp。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1ATP13A2基因Ala1144Thr位點(diǎn)PCR擴(kuò)增及直接測(cè)序結(jié)果Ala1144Thr多態(tài)位點(diǎn)基因型分為野生型CC型，純合變異TT型和雜合變異CT型，應(yīng)用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，在420例SPD患者和400例正常對(duì)照組中，僅發(fā)現(xiàn)1例男性維吾爾族PD患者(42歲，病程4年)發(fā)生雜合CT基因型變異，且這例PD患者是EOPD患者，未發(fā)現(xiàn)有純合變異TT基因型。所有漢族SPD患者和正常對(duì)照組未均未發(fā)現(xiàn)雜合變異CT基因型和純合變異TT基因型。ATP13A2基因Ala1144Thr位點(diǎn)經(jīng)PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物片段的理論值為323 bp，在2.0 %瓊脂糖凝膠上電泳可顯示該P(yáng)CR的擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖1。ATP13A2基因Ala1144Thr位點(diǎn)直接測(cè)序圖：Ala1144Thr多態(tài)基因型以CC野生型為主，雜合子變異CT基因型極少，未發(fā)現(xiàn)有純合子變異TT基因型。直接測(cè)序結(jié)果見圖2所示(SNP位點(diǎn)反向測(cè)序圖，圖中箭頭所指為堿基替換處)：上圖為CC型；下圖為CT型；從下圖可以看出從左向右第5個(gè)本來是C的，結(jié)果突變成了T，測(cè)序結(jié)果為雜合變異，雙峰圖。

1～7：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖圖1　Ala1144Thr PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

上圖:CC型；下圖:CT型圖2　Ala1144Thr位點(diǎn)直接測(cè)序圖

2.2ATP13A2基因Ala1144Thr位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

2.2.1PD組與正常對(duì)照組Ala1144Thr位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較ATP13A2基因Ala1144Thr位點(diǎn)在PD組和正常對(duì)照組基因型頻率及等位基因型頻率分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　不同年齡、不同性別新疆維吾爾族及漢族PD與正常對(duì)照組Ala1144Thr基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.2.2不同年齡、不同性別新疆維吾爾族及漢族PD與正常對(duì)照組Ala1144Thr基因型及等位基因頻率比較Ala1144Thr基因型及等位基因型頻率在男性PD組與女性PD組，男性PD組與男性正常對(duì)照組，女性PD組與女性正常對(duì)照組，EOPD亞組與LOPD亞組，EOPD亞組與≤50歲正常對(duì)照組，LOPD亞組與>50歲正常對(duì)照組，EOPD亞組男性組與EOPD亞組女性組，LOPD亞組男性組與LOPD亞組女性組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2.3不同民族PD與對(duì)照組Ala1144Thr基因型及等位基因頻率比較Ala1144Thr位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在維族PD與漢族PD，維族PD與維族正常對(duì)照組，漢族PD與漢族正常對(duì)照組，維族EOPD亞組與漢族EOPD亞組，漢族EOPD亞組與≤50歲漢族正常對(duì)照組，維族EOPD亞組與≤50歲維族正常對(duì)照組，維族LOPD亞組與漢族LOPD亞組，漢族LOPD亞組與>50歲漢族正常對(duì)照組，維族LOPD組與>50歲維族正常對(duì)照組各個(gè)組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3Ala1144Thr位點(diǎn)不同基因表型(野生型CC與雜合變異CT型)PD患者臨床資料比較在420例SPD患者和400例正常對(duì)照組中，Ala1144Thr位點(diǎn)發(fā)生雜合突變CT基因型的僅有1例EOPD患者，這1例EOPD患者基本情況及量表測(cè)評(píng)結(jié)果如下，野生CC基因型SPD患者共419例，由于變異樣本量極少，故不同基因表型PD臨床資料方面對(duì)比無法得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論。

3　討　論

ATP13A2基因位于1號(hào)染色體上，共編碼29個(gè)外顯子，Ala1144Thr位點(diǎn)位于1號(hào)染色體上第28號(hào)外顯子上，Ala1144Thr多態(tài)性位點(diǎn)為C→T轉(zhuǎn)換，丙氨酸被蘇氨酸代替(Ala→Thr)。到目前為止，ATP13A2基因的研究熱點(diǎn)主要集中在該基因位點(diǎn)突變與PD的相關(guān)性方面，但研究結(jié)果表明ATP13A2基因突變率極低，且僅發(fā)生在某些特殊種類的PD患者中〔4〕。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)1例維吾爾族PD患者發(fā)生Ala1144Thr位點(diǎn)雜合變異CT基因型，且這例PD患者為EOPD患者，該患者焦慮、抑郁、震顫、平衡障礙程度均較為嚴(yán)重，但由于變異樣本量少，與野生CC基因型的SPD患者無法做比較，故今后研究仍需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行相關(guān)研究。Ala1144Thr位點(diǎn)突變率在本研究中的SPD患者中占0.24%，與目前研究認(rèn)為的ATP13A2基因突變總體頻率較低結(jié)果基本一致。但因目前國(guó)內(nèi)外缺乏關(guān)于Ala1144Thr位點(diǎn)突變的相關(guān)報(bào)道，本研究結(jié)果尚需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，重復(fù)驗(yàn)證，減少假陽(yáng)性和假陰性可能，以找出真正與PD發(fā)病相關(guān)的易感基因多態(tài)及突變位點(diǎn)。

維吾爾族與漢族存在不同的社會(huì)遺傳背景，研究結(jié)果表明ATP13A2基因Ala1144Thr位點(diǎn)基因型及等位基因型頻率在這兩個(gè)民族間可能存在較小的差異性；分析其原因考慮雖然不同民族間其遺傳結(jié)構(gòu)可能存在不同，但由于不同民族人群長(zhǎng)期所處環(huán)境相同，期間一些生活習(xí)慣的彼此融合，不可避免的都或多或少對(duì)基因有所影響，基因多態(tài)性分布可以趨向于差異減小。ATP13A2基因位點(diǎn)Ala1144Thr基因型及等位基因型頻率多態(tài)性可能與性別及年齡關(guān)系也不顯著。Ala1144Thr多態(tài)性與性別及年齡的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏相關(guān)報(bào)道，仍需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究該位點(diǎn)多態(tài)與PD性別及年齡的關(guān)系。不同于FPD，占絕大數(shù)量的SPD病因上很大程度仍不清楚，只有基于流行病學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的遺傳易感性的報(bào)道。但是應(yīng)該指出的是，PD的基因數(shù)據(jù)的報(bào)道提示沒有單一的常見基因多態(tài)能夠改變PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)〔5，6〕。選擇基因同質(zhì)人群、進(jìn)行表型分析和謹(jǐn)慎的分析解釋數(shù)據(jù)以確保這些研究的正確發(fā)展。

1Park JS,Mehta P,Cooper AA.Pathogenic effects of novel mutations in the P-type ATPase ATP13A2(PARK9)causing Kufor-Rakeb syndrome,a form of early-onset parkinsonism〔J〕.Hum Mutat,2011;32(12):956-64.

2Ning YP,Kanai K,Tomiyama H,etal.PARK9-linked parkinsonism in eastern Asia:mutation detection in ATP13A2 and clinical phenotype〔J〕.Neurology,2008;70(12):1491-3.

3Xiromerisiou G,Dardiotis E,Tsimourtou V,etal.Genetic basis of Parkinson disease〔J〕.Neurosurg Focus,2010;34(4):28-9.

4Mao XY,Burgunder JM,Zhang ZJ,etal.ATP13A2 G2236A variant is rare in patients with early-onset Parkinson′s disease and familial Parkinson′s disease from Mainland China〔J〕.Parkinsonism Relat Disord,2010;16(2):235-6.

5Crosiers D,Ceulemans B,Meeus B.Juvenile dystonia-parkinsonism and dementia caused by a novel ATP13A2 frameshift mutation〔J〕.Parkinsonism Relat Disord,2011;17(1):135-8.

6Martin I,Dawson VL,Dawson TM.The impact of genetic research on our understanding of Parkinson′s disease〔J〕.Prog Brain Res,2010;183(1):21-4.