王玉田，鄭瑞峰，韓明渠，李富偉

（ 1.北京市畜牧總站，北京 100101；2.北京科為博生物技術(shù)研究院，北京 102609）

蛋白酶和淀粉酶都是重要的水解酶類，已在飼料、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。在飼料行業(yè)中，蛋白酶和淀粉酶以內(nèi)源性消化酶添加到飼料中補充動物自身消化酶分泌不足。許多研究結(jié)果表明，飼料中添加蛋白酶和淀粉酶可提高飼料利用率、促進動物生長、減少糞便的排放，在改善養(yǎng)殖環(huán)境以及防治動物疾病等方面具有明顯效果[2-3]。

由于芽胞桿菌分泌的蛋白酶和淀粉酶大多為胞外酶，其與動植物源的蛋白酶和淀粉酶相比具有菌體篩選簡單易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高、價格低廉等優(yōu)點，使得芽胞桿菌源蛋白酶和淀粉酶的研究成為國內(nèi)外研究熱點[4]。本試驗研究通過平板初篩結(jié)合酶活力測定，旨在篩選具有高產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶復(fù)合酶能力的芽孢桿菌菌株。

1 試驗材料

1.1 菌種

北京科為博生物技術(shù)研究院實驗室保藏的芽孢桿菌。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 初篩培養(yǎng)基

產(chǎn)蛋白酶初篩培養(yǎng)基：酪素10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉16 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌30 min。

產(chǎn)淀粉酶初篩培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，葡萄糖5 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉16 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌30 min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.2 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌30 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉30 g，黃豆餅粉20 g（水解液，加0.5%NaOH，121℃水解30 min，冷卻、過濾）、蛋白胨2 g，KH2PO41.5 g，K2HPO41.5 g，（NH4）2SO41.5 g，MnSO40.1 g，MgSO40.6 g，NaCl 2 g，葡萄糖 5 g，CaCl20.3 g，吐溫-80 0.3 mL，蒸餾水1 L（pH自然，121℃滅菌30 min）。

2 試驗方法

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩

將芽孢桿菌菌種活化，接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，芽孢桿菌活化液分別接種于酪素瓊脂平板和可溶性淀粉平板上，37℃培養(yǎng)2～4 d，然后觀察酪素瓊脂平板有無水解圈，判斷芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活性，通過盧戈氏碘液染色法確定是否產(chǎn)淀粉酶。

2.1.2 復(fù)篩

將活化的芽孢桿菌菌液接種于種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，然后以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，160 r·min-1，搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵培養(yǎng)24 h后補加葡萄糖使整個發(fā)酵過程中葡萄糖含量大約保持在0.5%。離心（4 000 r·min-1，20 min）收集上清液即為待測粗酶液，采用福林酚法測定粗酶液蛋白酶活力，采用碘液法測定淀粉酶活力[5-6]。

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

觀察劃線純化后的菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色鏡檢。

2.2.2 生理生化鑒定

接觸酶、氧化酶測定及碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗方法，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]。

2.2.3 分子生物學鑒定

gyrB基因的PCR擴增與測序：以基因組DNA為模板PCR擴增gyrB基因，擴增引物采用gyrB-（5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3'）和gyrB-R（5'-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成）[8]。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，10 mol·L-1引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，DNA模板1μL，ddH2O補足至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，32個循環(huán)，最后72℃10 min，擴增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析：擴增產(chǎn)物序列測定由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，然后選擇相似性較高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進行多序列同源性比對，用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次重復(fù)的Bootstraps統(tǒng)計學檢驗。

3 試驗結(jié)果

3.1 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶芽孢桿菌的篩選

通過酪素平板和可溶性淀粉平板初篩，得到6株同時具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶的芽孢桿菌菌株。發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果見表1。菌株CA01216和CA02003有較高蛋白酶活力，分別為7 126.55、8 723.16 U·L-1，菌株CA01027和CA02003有較高的淀粉酶活力，分別為274.96、251.19 U·L-1。其中，菌株CA02003的蛋白酶和淀粉酶活力均較高。

表1 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶芽孢桿菌篩選

3.2 菌種鑒定

3.2.1 形態(tài)特征、生理生化特征

細胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢，孢囊不膨大。接觸酶、氧化酶反應(yīng)和VP試驗均呈陽性，β-半乳糖苷酶呈陰性，生長試驗和碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗結(jié)果見表2。

表2 生理生化特征

2.2.2 gyrB基因序列系統(tǒng)進化分析

菌株CA02003的gyrB基因測序結(jié)果在GenBank中進行Blast比對分析，其序列全長為1 113 bp，與芽孢桿菌屬的gyrB基因序列相似性最高。選取Paenibacillusamylolyticus BCRC 14684（EU272024）作為外類群，利用Mega 6.0軟件構(gòu)建菌株CA02003與芽孢桿菌屬部分模式種gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹。如附圖所示，菌株CA02003與Bacillus licheniformis BCRC 11702（DQ309295）同處一個進化分支，親緣關(guān)系最近。

附圖 gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

通過菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株CA02003初步鑒定為地衣芽孢桿菌。

4 討論

本試驗研究采用酪素平板和可溶性淀粉平板初篩，產(chǎn)酶活力測定復(fù)篩，得到一株具有產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶復(fù)合酶芽胞桿菌菌株CA02003。通過形態(tài)特征、生理生化特征以及gyrB基因進化分析結(jié)果，鑒定為地衣芽孢桿菌。

目前，產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的微生物菌株的文獻報道很多。馬校衛(wèi)等從高溫大曲樣品中篩選獲得1株產(chǎn)耐熱性蛋白酶的蘇云金芽孢桿菌[9]。魯珍等從高溫大曲樣品中篩選獲得1株高產(chǎn)中性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌，優(yōu)化后產(chǎn)酶能力達到706.13 U·g-1[10]。李習從白云邊高溫大曲中篩選得到的產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶地衣芽孢桿菌，淀粉酶活力達到334.32 U·mL-1[11]。王鵬昊等從白酒酒曲中篩選得到的米曲霉具有較高的蛋白酶活力（酶活性為324.72 U·g-1）和α-淀粉酶活力（225.76 U·g-1干曲）[12]。但高產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶復(fù)合酶芽胞桿菌的研究報道很少，本文研究篩選獲得的地衣芽孢桿菌具有高產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶復(fù)合酶能力，在酶制劑生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。

[參考文獻]

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[2] Ludovic,Lahaye,Robert,等.蛋白酶在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料與畜牧:新飼料,2011（7）:41-45.

[3] 唐小懿,馬杰,王興吉.淀粉酶在畜禽飼料中的應(yīng)用研究進展[J]. 飼料研究,2017（11）:4-7.

[4] 秦艷梅,劉春卯,鄭翔,等.微生物中性蛋白酶在食品工業(yè)的最新進展及應(yīng)用前景[J].食品工業(yè),2017,38（3）:210-213.

[5] 中華人民共和國國家標準.GB/T 23527-2009蛋白酶制劑[S].

[6] 中華人民共和國國家標準.GB/T 24401-2009α-淀粉酶制劑[S].

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[8] Nochi Z,Sahebekhtiari N,Kharaziha P,et al.Comparison of 16S rRNA,23S rRNA and gyrB genes sequences in phy?logenetic relationships of Shigella isolates from Iran[J].An?nals of Microbiology,2009,59（3）:615-622.

[9] 馬校衛(wèi), 顏林春,湯二將,等.高溫大曲中產(chǎn)耐熱性蛋白酶芽孢桿菌的篩選和鑒定[J].食品工業(yè)科技,2012,33（15）:169-173.

[10] 魯珍,諶馥佳,李恩中,等.高產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學,2016（5）:110-113.

[11] 李習.高產(chǎn)α-淀粉酶地衣芽孢桿菌的篩選及重組質(zhì)粒的構(gòu)建[D].武漢:湖北工業(yè)大學,2014.

[12] 王鵬昊,關(guān)統(tǒng)偉,鄧奧宇,等.酒曲中高產(chǎn)蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的篩選與分子鑒定[J].釀酒科技,2016（6）:61-64,71．