張雪飛，王宏偉*，韓少杰，譚攀攀，李小婷，周變?nèi)A

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471000；2.山東省濰坊市昌樂縣畜牧獸醫(yī)局，山東濰坊 262400)

青蒿(Artemisiaannua)通稱黃花蒿，性寒，味苦，具有清熱解暑、除蒸截瘧等功效。早在《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》等醫(yī)學(xué)典籍中就有其抗瘧疾、抗寄生蟲以及增強免疫力等功能的記載。青蒿素(artemisinin)是從青蒿葉中提取的一種新型倍半萜內(nèi)酯物質(zhì)，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，具有速效和低毒的特性，是繼乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后最有效的新型抗瘧疾藥[1]。大量的實際應(yīng)用表明，青蒿素對改善由寄生蟲病引起的病理變化和炎癥反應(yīng)效果明顯，具有良好的抗寄生蟲作用。為最大限度地挖掘青蒿素的藥效，目前已研發(fā)出多種高效的青蒿素衍生物，如雙氫青蒿素(dihydroartemisinin)、蒿甲醚(artemether)、蒿乙醚(arteether)和青蒿琥酯(artesunate)等，這些產(chǎn)品都已在臨床應(yīng)用中取得較好的效果[2]。本文將就青蒿素及其衍生物在抗寄生蟲方面的研究進展做一綜述。

1　青蒿素及其衍生物抗球蟲

球蟲(Coccidia)可感染多種哺乳動物和禽類，雞球蟲病的暴發(fā)給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。雞感染球蟲后臨床癥狀主要表現(xiàn)為消瘦、貧血和大量血便等癥狀，剖檢可見雞盲腸發(fā)生嚴(yán)重的病理形態(tài)學(xué)損傷和炎癥反應(yīng)。研究證實，青蒿素及衍生物均能提高機體免疫能力，有效減輕炎癥反應(yīng)，改善球蟲感染雞盲腸病變，恢復(fù)機體正常的生理功能。此外，青蒿素的抗球蟲效果與其用藥量密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，不同青蒿素提取物對雞球蟲卵囊孢子化的影響也不盡相同，每升石油醚中添加2 ng或5 ng青蒿素提取物球蟲卵囊孢子化率分別為42.3%和45.3%，而在960 mL/L乙醇添加2 ng/L和5 ng/L青蒿素提取物，其孢子化率分別為35.2%和46.0%[3]，這表明，青蒿素提取物的抗球蟲效果與其濃度和添加方式有關(guān)。有試驗發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物抗球蟲效果與球蟲種類也有密切聯(lián)系。據(jù)報道，5 mg/L濃度的青蒿素不但能改善堆型艾美耳球蟲感染雞的體重和飼料轉(zhuǎn)化率，而且能降低柔嫩艾美耳球蟲的卵囊孢子化率，而500 mg/L濃度的青蒿素才能夠顯著抑制堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的卵囊孢子化率[4]。目前，青蒿素的使用劑量沒有明確的安全標(biāo)準(zhǔn)，臨床上也沒有出現(xiàn)大劑量、長療程用藥導(dǎo)致的毒性反應(yīng)報道，因此，需結(jié)合長期毒性試驗的結(jié)果，綜合分析評價其安全用藥量。

在球蟲發(fā)育的每一階段中，細(xì)胞內(nèi)均有大量的線粒體存在，以裂殖生殖階段最為明顯[5]。據(jù)報道，青蒿素能明顯降低柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子線粒體的膜電位，并明顯提高促凋亡蛋白酶caspase-3的活性，誘導(dǎo)第2代裂殖子凋亡，減輕感染雞盲腸組織病變，以發(fā)揮抗球蟲作用[6]。這表明青蒿素可通過干擾促凋亡蛋白的表達及活性，影響線粒體膜電位達到抑制或殺滅球蟲的目的。此外，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)鈣離子對球蟲的發(fā)育極其重要。Emilio D C等[7]發(fā)現(xiàn)，青蒿素能引起球蟲大配子肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起鈣離子釋放，導(dǎo)致球蟲鈣離子代謝紊亂。進一步的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，青蒿素可破壞球蟲卵囊壁，顯著降低卵囊數(shù)量。這表明青蒿素通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，抑制球蟲的配子發(fā)育和卵囊的形成，達到抗球蟲的目的。

2　青蒿素及其衍生物抗瘧原蟲

瘧疾是一種以按蚊為主要傳播媒介的急性寄生蟲傳染病[8]。目前，認(rèn)為有5種瘧原蟲能引起人感染瘧疾，分別為惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和諾氏瘧原蟲[9-10]。瘧原蟲可引起宿主出現(xiàn)腦型瘧、重癥貧血、急性腎衰竭等致命癥狀，其中腦型瘧是引起患者死亡的主要原因[11]。近年來，隨著主流抗瘧疾藥物出現(xiàn)耐藥性，青蒿素則成為抗瘧疾的最為重要的藥物，并且無論單獨或與其他藥物聯(lián)合抗瘧疾都具有良好的效果，僅有極少數(shù)患者出現(xiàn)罕見的輕微毒性反應(yīng)。臨床試驗結(jié)果顯示，青蒿琥酯治療輸入性瘧疾的總治愈率為92.7%[12]。這表明青蒿素類藥物可治不同瘧疾，適用人群廣，耐受性好，可在短期內(nèi)治愈多數(shù)病人，并且無明顯不良反應(yīng)。

青蒿素具有損傷瘧原蟲線粒體，干擾線粒體內(nèi)核糖體利用氨基酸合成蛋白質(zhì)和酶的功能。線粒體蛋白質(zhì)的缺乏可使蟲體形成許多自噬泡，造成大量胞漿流失而死亡；青蒿素及其衍生物中有效成分經(jīng)血紅素催化后，產(chǎn)生可損傷瘧原蟲蟲膜上脂質(zhì)的自由基，進而破壞蟲體膜結(jié)構(gòu)，達到殺滅蟲體的目的。研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可干擾線粒體膜電位，使線粒體呼吸鏈功能喪失，誘導(dǎo)自由基損傷使細(xì)胞凋亡或死亡[13]。瘧原蟲寄生在宿主紅細(xì)胞中，通過分解血紅蛋白產(chǎn)生維持自身生長發(fā)育所需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生大量的亞鐵血紅素。鐵元素在青蒿素抗瘧原蟲中起關(guān)鍵的作用，血紅素中的二價鐵可催化青蒿素類藥物結(jié)構(gòu)中過氧橋，產(chǎn)生能與瘧原蟲蛋白質(zhì)結(jié)合的氧自由基并形成共價鍵，使瘧原蟲蛋白功能喪失，進而發(fā)揮抗瘧原蟲作用。

3　青蒿素及其衍生物抗血吸蟲

血吸蟲病(Schistosomiasis)是由裂體吸蟲屬血吸蟲引起的一種慢性寄生蟲病，可分為腸血吸蟲病和尿道血吸蟲病。我國常見的是腸血吸蟲，主要由日本血吸蟲引起，其發(fā)育分成蟲、蟲卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴及童蟲7個階段。尾蚴、童蟲、成蟲和蟲卵均可對宿主引起不同程度的損害和復(fù)雜的免疫病理反應(yīng)[14]。青蒿素及其衍生物已被證實具有抗血吸蟲作用，尤其是對血吸蟲的幼蟲期和童蟲期作用效果明顯。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚各300 mg/kg分別連續(xù)給藥或者以300 mg/kg 3種藥物混合液配伍給藥抗血吸蟲童蟲和成蟲階段，分別在感染6 d～8 d用藥和感染34 d～36 d用藥，小鼠減蟲率與減雌率無顯著差異[15]。這表明青蒿素類藥物在整個用藥期對童蟲和成蟲階段的血吸蟲具有殺滅作用，并且殺蟲效果與用藥量無明顯關(guān)系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，使用雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚治療日本血吸蟲吡喹酮抗性蟲株效果明顯，表明青蒿素類藥物與吡喹酮藥物之間不存在交叉耐藥性。

青蒿素類藥物中的過氧橋活性基團是抗血吸蟲的有效成分，通過影響蟲體糖代謝從而抑制或殺滅血吸蟲。據(jù)報道，經(jīng)蒿甲醚作用后的日本血吸蟲尾蚴，雌蟲的己糖激酶、蘋果酸脫氫酶、蘋果酸酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶活性呈下降趨勢，且醛縮酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶以及6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶的活性也明顯降低，甚至被抑制，而對雄蟲無明顯效果甚至無效?？梢娸锛酌褜ρx雌蟲的糖代謝具有明顯的抑制效果。也有學(xué)者指出，蒿甲醚可降低肝期血吸蟲體內(nèi)糖元分泌，抑制堿性磷酸酶活力，導(dǎo)致體表腸管和生殖腺形態(tài)異常以及蟲體萎縮，體內(nèi)蛋白質(zhì)含量明顯減少，尤其雌蟲最明顯[16]。此外，青蒿素類藥物抗瘧原蟲的機制是過氧橋與原蟲體內(nèi)的鐵元素發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可損傷原蟲自由基，而血吸蟲在宿主體內(nèi)也是通過攝取紅細(xì)胞滿足自身營養(yǎng)需求，體內(nèi)血紅素與Fe2+反應(yīng)催化青蒿素中的過氧橋基團，使之產(chǎn)生大量能損害蟲體的自由基從而達到抑制或是殺滅血吸蟲的目的，這與青蒿素類藥物抗瘧原蟲機制相似。

4　青蒿素及其衍生物抗弓形蟲

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)呈細(xì)胞內(nèi)專性寄生，主要寄生于大腦，可引起人畜共患弓形蟲病[17]。研究表明，在非病毒感染性腦病中，弓形蟲腦病發(fā)生率僅次于結(jié)核性腦炎和隱球菌腦炎。人感染后免疫功能下降，從而引發(fā)各種疾病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致免疫力低下者死亡、造成孕婦流產(chǎn)、死胎、畸形胎等。近年來，已有研究證實青蒿素及其衍生物具有良好的抗弓形蟲效果。在體外抗弓形蟲試驗中，3 μL/mL青蒿酯鈉抑制弓形蟲對Hela細(xì)胞的感染及蟲體分裂增殖效果優(yōu)于25 μL/mL乙胺嘧啶[18]。表明低劑量的青蒿素類藥物具有良好的抗弓形蟲作用。陳炘等[19]報道，使用雙氫青蒿素哌喹片(dihydroartemisinin and piperaquine phosphate tablets)和青蒿琥酯片(artesunate tablets)治療弓形蟲腦病，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素哌喹片和青蒿琥酯片與復(fù)方磺胺甲惡唑聯(lián)合阿奇霉素具有協(xié)同作用，可增強治療效果，顱內(nèi)病灶明顯吸收好轉(zhuǎn)，優(yōu)于磺胺甲惡唑、阿奇霉素單獨治療。

研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物能有效抑制弓形蟲的心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)基因片段在酵母菌中的表達[20]。這表明SERCAs可能是青蒿素類藥物的作用靶點。青蒿素類藥物還可通過干擾弓形蟲的二氫葉酸還原成四氫葉酸，導(dǎo)致弓形蟲蛋白功能異常或喪失。此外，青蒿素類藥物可通過干擾弓形蟲能量代謝，抑制其發(fā)育和增殖。經(jīng)蒿甲醚作用的弓形蟲，體內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶活性降低，蟲體膜外周的黑色沉淀減少，并且圍蟲泡內(nèi)的蟲體葡萄糖-6-磷酸酶也受到一定影響。尹衛(wèi)東等[21]觀察雙氫青蒿素單獨用藥或與阿奇霉素聯(lián)合用藥對弓形蟲速殖子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論單獨用藥還是聯(lián)合用藥，均使速殖子出現(xiàn)水腫，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞質(zhì)脂滴增多、形成空泡。這表明單用雙氫青蒿素或與阿奇霉素聯(lián)用，均可破壞弓形蟲速殖子的細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能，可導(dǎo)致蟲體代謝異常，進而抑制蟲體的發(fā)育或殺滅蟲體。

5　青蒿素及其衍生物抗藍氏賈第鞭毛蟲

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)又稱賈第蟲，是一種常見的腸道寄生性原蟲，主要寄生在哺乳動物的小腸、膽囊、十二指腸內(nèi)，已被列為全世界危害人類健康的十種主要寄生蟲之一[22]。它主要感染兒童和免疫功能受損人群及動物，可引起宿主腹痛、腹瀉和吸收不良等癥狀。目前，該病的主要治療藥物有甲硝唑、替硝唑、甲苯達唑等藥物，這些藥物治療效果無明顯差異,而且均已出現(xiàn)耐藥性、不良反應(yīng)及毒性損傷等。已有研究證實，青蒿素類藥物可殺滅賈第蟲，并且毒副作用小，其中雙氫青蒿素抗賈第蟲效果最顯著。田喜鳳等[23]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雙氫青蒿素作用后的賈第蟲，蟲體畸形、表面出現(xiàn)突起；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖體溶解，出現(xiàn)空泡；細(xì)胞膜崩解、脫落、膜下微管被破壞；吸器膜下微管結(jié)構(gòu)受損失去凹狀結(jié)構(gòu)；核染色質(zhì)稀疏，核周間隙變寬，并出現(xiàn)異形核。這表明雙氫青蒿素可使細(xì)胞形態(tài)功能異常，致使吸器螺旋微管結(jié)構(gòu)破壞，引起鞭毛功能喪失，最終導(dǎo)致滋養(yǎng)體無法攝取所需養(yǎng)分，以達到抑制蟲體生長發(fā)育或殺滅蟲體的目的。

藍氏賈第鞭毛蟲的滋養(yǎng)體借助前端的吸盤和鞭毛，吸附于宿主腸道上皮細(xì)胞表面以攝取生長所需營養(yǎng)，導(dǎo)致宿主腸黏膜吸收營養(yǎng)面積大量減少，并造成腸上皮細(xì)胞微絨毛損傷，最終引起腸黏膜吸收功能異常[24]。在此過程中，吸盤和鞭毛的協(xié)同作用是在賈第蟲獲取養(yǎng)分，對宿主產(chǎn)生病理形態(tài)學(xué)損傷起至關(guān)重要的作用。吸盤和鞭毛主要是由微絲、微管等細(xì)胞骨架組成，因此細(xì)胞骨架與賈第蟲的致病性密切相關(guān)。研究證實，雙氫青蒿素對體外培養(yǎng)的賈第蟲滋養(yǎng)體具有損傷作用，通過電鏡可見質(zhì)膜下出現(xiàn)空泡，吸盤上隆起一個空腔，滋養(yǎng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)異?；蚧?，其中微絲、微管被破壞。表明雙氫青蒿素可破壞胞膜和吸盤的骨架結(jié)構(gòu)，使其正常生理功能喪失，進而抑制蟲體發(fā)育或致其死亡。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，賈第蟲骨架結(jié)構(gòu)中含有一種特有成分“賈第素”，其中α-賈第素可能是進化過程中膜聯(lián)蛋白的代表，并且很可能具有保守的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，而行使相似的功能[25]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的雙氫青蒿素對藍氏賈第鞭毛蟲的α-賈第素(Alpha-7.3 giardin)基因mRNA的表達抑制效果明顯，并且抑制效果與藥物濃度和用藥時間成正比。這表明雙氫青蒿素對賈第蟲的細(xì)胞骨架蛋白具有損傷作用，可見雙氫青蒿素治療賈第蟲效果顯著，揭示了細(xì)胞骨架成分可能是青蒿素類藥物的作用靶點。

6　青蒿素及其衍生物抗卡氏肺孢子蟲

卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)是一種常見的機會性致病寄生蟲，可引起卡氏肺孢子蟲肺炎，多發(fā)于免疫缺陷人群，尤其是艾滋病患者[26]。當(dāng)宿主免疫力低下時，處于潛伏狀態(tài)的蟲體即進行大量繁殖，引發(fā)間質(zhì)性漿細(xì)胞性肺炎，引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病。對于該病的治療，臨床上多以復(fù)方磺胺甲惡唑和噴他脒為主，但因其具有一定毒副作用，尤其治療艾滋病患者毒副反應(yīng)較強，在實際使用中受到限制。青蒿素類藥物作為高效、低毒、廣譜抗寄生蟲藥物已被證實具有抗卡氏肺孢子蟲效果。據(jù)報道，觀察雙氫青蒿素、青蒿琥酯對體外培養(yǎng)的卡氏肺孢子蟲作用效果發(fā)現(xiàn)，在卡氏肺孢子蟲滋養(yǎng)體和包囊生長高峰期時，50 μmol/L雙氫青蒿和100 μmol/L青蒿琥酯的滋養(yǎng)體抑制率分別為88.0%和90.1%，而包囊抑制率分別為67.5%和67.3%，與15 μmol/L噴他脒抑制效果無明顯區(qū)別[27]。由此得知，兩種青蒿素類藥物在一定濃度均具有抑制卡氏肺孢子蟲的作用，效果與化學(xué)藥物相當(dāng)；當(dāng)濃度增加時滋養(yǎng)體抑制率上升，揭示青蒿素類藥物抗卡氏肺孢子蟲效果可能與藥物濃度有關(guān)。

對青蒿素類藥物抗卡氏肺孢子蟲作用機制探究發(fā)現(xiàn)，青蒿素類藥物可損傷蟲體的細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，通過破壞蟲體表膜結(jié)構(gòu)抑制蟲體發(fā)育或殺滅蟲體。研究發(fā)現(xiàn)，卡氏肺孢子蟲經(jīng)雙氫青蒿素和青蒿琥酯分別作用2 h后，蟲體表膜的微絨毛開始脫落變形。隨著作用時間延長，細(xì)胞膜上出現(xiàn)大小不等的凹陷性損傷，甚至內(nèi)部結(jié)構(gòu)外漏，與噴他脒作用后表膜出現(xiàn)蜂窩狀大小不等的空洞結(jié)構(gòu)相似[28]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素使卡氏肺孢子蟲滋養(yǎng)體和包囊的胞質(zhì)中出現(xiàn)大空泡，核膜破裂，部分滋養(yǎng)體和包囊的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，線粒體形態(tài)異常。說明青蒿素類藥物可通過破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜的正常結(jié)構(gòu)，干擾卡氏肺孢子蟲膜系功能，增加蟲體表膜通透性，使表膜無法發(fā)揮正常的生理功能，引起蟲體代謝異常，從而達到殺蟲效果。此外，也有學(xué)者認(rèn)為寄生蟲引起宿主細(xì)胞凋亡，是其致宿主細(xì)胞損傷的重要機制。李文桂等[29]指出，用60 mg/kg的雙氫青蒿素治療大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎，用PI和TUNEL染色法檢測脾細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可明顯抑制卡氏肺孢子蟲引起的脾細(xì)胞大量凋亡。據(jù)此推測青蒿素類藥物可下調(diào)卡氏肺孢子蟲誘導(dǎo)的促脾細(xì)胞凋亡分子的表達，從而發(fā)揮抑制脾細(xì)胞凋亡的作用。

7　結(jié)語

迄今為止寄生蟲病在全球范圍內(nèi)仍無法攻克，而且多數(shù)寄生蟲為隱性感染，未能引起人們的廣泛重視。隨著寄生蟲病的不斷發(fā)生，主流抗寄生蟲藥物已出現(xiàn)一些安全問題，如耐藥性、藥物殘留、毒副作用等一系列的問題。研究和開發(fā)新型、高效、低毒的抗寄生蟲藥物迫在眉睫。青蒿以價格低廉、副作用低、且不易產(chǎn)生交叉耐藥性等優(yōu)點成為學(xué)者關(guān)注的焦點。青蒿素及其衍生物對球蟲、瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、肺孢子蟲和藍氏賈第鞭毛蟲等多種寄生蟲表現(xiàn)出了良好的作用效果，但其殺蟲機制還尚未明確。隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的提高以及結(jié)合更多的實驗室研究，對寄生蟲生理、生化、代謝、蟲體與宿主病理、免疫等關(guān)系進一步研究，明確其作用過程，這無疑對中藥抗寄生蟲病具有重大意義。