汪冬冬,宋亞誼,陳 功,3,李 恒,3,申文熹,伍亞龍, 王 勇,唐 垚,章宇丹,張 偉,朱 翔,張其圣,3,*

(1.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,四川眉山 620000;2.四川大學(xué)錦江學(xué)院,四川眉山 620860； 3.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,四川溫江 611130)

泡菜是中國(guó)典型傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵制品,其發(fā)酵過(guò)程中微生物體系龐大且復(fù)雜。探明泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演變與動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,有利于了解并掌控泡菜的發(fā)酵過(guò)程,進(jìn)而保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全性。楊瑞等發(fā)現(xiàn)泡菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌處于優(yōu)勢(shì)地位并抑制發(fā)酵初期中占優(yōu)勢(shì)的大腸埃希氏菌等雜菌生長(zhǎng)[1]。盛海圓等研究表明泡菜中乳桿菌屬占主要優(yōu)勢(shì),其次為腸球菌屬、葡萄球菌屬和片球菌屬,其中乳桿菌中植物乳桿菌占明顯優(yōu)勢(shì)[2]。張先琴等研究表明在泡菜細(xì)菌中乳桿菌屬是優(yōu)勢(shì)種群，占總數(shù)的56%[3]。趙永威等研究結(jié)果顯示腌制冬瓜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌有乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和葡萄球菌屬等[4]?，F(xiàn)有報(bào)道的泡菜發(fā)酵乳酸菌包括10余個(gè)屬100多個(gè)種[5],而乳桿菌屬,尤其是植物乳桿菌是廣泛報(bào)道的主導(dǎo)泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物[6]。泡菜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物的生長(zhǎng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,而且由于培養(yǎng)基的選擇性以及不可培養(yǎng)微生物的影響,無(wú)法快速準(zhǔn)確地反映泡菜發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落構(gòu)成及動(dòng)態(tài)變化;而采用免培養(yǎng)方法如PCR-DGGE和高通量測(cè)序,耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、只能反映相對(duì)構(gòu)成。

近年來(lái),qPCR技術(shù),即實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品微生物的快速檢測(cè),此方法可以目的明確、快速、準(zhǔn)確計(jì)量發(fā)酵體系中特定微生物,在發(fā)酵蔬菜和發(fā)酵橄欖中也有一些應(yīng)用[7-8]。石慧等采用qPCR結(jié)合DNA染料的方法,建立了快速檢測(cè)泡菜中乳酸菌活菌的EMA-qPCR法[9]。孟霞等采用18S rDNA克隆文庫(kù)結(jié)合ARDRA分型分析對(duì)青菜泡菜發(fā)酵過(guò)程真菌的多樣性進(jìn)行研究,并采用qPCR方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,兩種方法結(jié)果基本吻合[10]。魏娜等通過(guò)qPCR技術(shù),定量分析不同窖齡窖泥中的古菌、總細(xì)菌和群瘤胃菌、乳桿菌和毛螺旋菌三種優(yōu)勢(shì)菌群[11]。周曉紅等采用qPCR方法檢測(cè)沙門菌、志賀菌等食源性致病菌[12]。

為快速定量監(jiān)控泡菜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化,本實(shí)驗(yàn)建立了利用qPCR技術(shù)快速檢測(cè)植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的方法,以期為泡菜發(fā)酵質(zhì)量的快速判定以及深入了解、控制泡菜發(fā)酵過(guò)程提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

結(jié)球甘藍(lán)、食鹽 眉山某超市;2xSG Fast qPCR Master Mix 上海生工生物;Bacterial DNA Isolation Kit、Taq PCR Master Mix 成都福際生物;PCR引物 成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司;DNase/RNase-Free Deionized Water 北京天根生化;BHI培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、無(wú)水乙醇 眉山和通化工;目標(biāo)菌株由四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院提供(見(jiàn)表1)。

表1 目標(biāo)菌及其qPCR擴(kuò)增引物Table 1 Dominant bacteria and qPCR amplification primers

高速離心機(jī) Thermo Scientific;單人單面凈化工作臺(tái) 蘇凈凈化有限公司;T960PCR儀 杭州晶格有限公司;DYY-8C電泳儀 北京六一有限公司;JY04S-3E凝膠成像儀 君意東方有限公司;實(shí)時(shí)熒光PCR儀 Bio-Rad;立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申有限公司;JD200-3電子天平 龍騰電子有限公司;DHP-9270B電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海瑯玕有限公司;HH-4恒溫水浴鍋 江蘇澳華儀器有限公司;電子萬(wàn)用爐 北京永光明有限公司;QL-901旋渦混合器 江蘇其林貝爾有限公司;Mini-6K低速離心機(jī) 杭州奧盛有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泡菜制作及取樣 將泡菜壇和新鮮結(jié)球甘藍(lán)清洗干凈,結(jié)球甘藍(lán)切好備用,稱取700 g切好的結(jié)球甘藍(lán)放入泡菜壇中,加入備好的純凈水1400 mL,加入42 g食鹽,25 ℃恒溫發(fā)酵;同時(shí)泡制兩壇泡菜。分別于0、1、2、3、5、7、10 d取泡菜發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次取樣5 mL,置于-20 ℃密封保存。取樣時(shí)先將泡菜輕輕搖勻,取周邊4 個(gè)點(diǎn)和中間2 個(gè)樣進(jìn)行混合。

1.2.2 樣品總DNA提取 采用試劑盒(Bacterial DNA Isolation Kit)方法提取泡菜發(fā)酵液樣品的DNA,-20 ℃密封保存。具體操作步驟如下:在1.5 mL離心管中加入1.5 mL樣品,12000 r/min室溫離心1 min,吸盡上清液,向離心管中加入0.16 mL Buffer EB,重懸菌體;再加入40 μL溶菌酶(50 mg/mL),漩渦混勻,37 ℃放置30 min;7200 r/min離心3 min,除去上清液。向沉淀中加入380 μL Buffer ML1,旋渦震蕩使菌體徹底懸浮;加入20 μL Foregene Protease,旋渦混勻;將離心管于65 ℃水浴30 min,并每隔10 min漩渦混勻一次;加入380 μL Buffer ML2,顛倒混勻,65 ℃水浴10 min;12000 r/min離心10 min。吸取750 μL上清至新離心管,加入150 μL無(wú)水乙醇,劇烈震蕩至充分混勻。將混合液移至離心柱,12000 r/min離心1 min,棄掉收集管中廢液。向離心柱中加入500 μL Buffer PW,12000 r/min離心1 min,棄掉收集管中廢液。向離心柱中加入700 μL Buffer WB,12000 r/min離心1 min,棄掉收集管中廢液,并重復(fù)操作一次。12000 r/min空管離心2 min,將離心柱移至新的1.5 mL離心管中,向膜中央懸滴100 μL已65 ℃預(yù)熱的Buffer EB,室溫放置5 min,12000 r/min離心1 min。將離心管中洗脫液移回至離心柱,12000 r/min離心1 min,收集洗脫液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備 分別將菌株12CR5在MRS培養(yǎng)基中,3Z8D25和1S5D25在PCA培養(yǎng)基中、0R3在BHI培養(yǎng)基中活化后,采用試劑盒方法提取純化DNA。再進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA序列PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT),擴(kuò)增體系(50 μL):2×PCR Mix 25 μL、模板DNA 1.5 μL、引物27F(10 μmol/L)和1492R(10 μmol/L)各2 μL,加雙重蒸餾水補(bǔ)充至50 μL;擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性10 min;93 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35次循環(huán);72 ℃延伸10 min。用2.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物(大小約1500 bp)進(jìn)行電泳檢測(cè),將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備,質(zhì)粒拷貝濃度C/(copy/mL)計(jì)算公式[17]:

C=[DNA amount(g/mL)×6.02×1023(copy/mole)]/[DNA length(bp)×660(g/mole/bp)]

1.2.4 qPCR擴(kuò)增 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表2,擴(kuò)增程序見(jiàn)表3:

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒依次10倍稀釋得1012～106copies/mL的梯度濃度,將其作為DNA模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序見(jiàn)1.2.4中表2和表3。每種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做兩組平行樣,每組模板梯度加入一個(gè)空白對(duì)照,取其平均值,以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒初始拷貝濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),相應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算其擴(kuò)增效率E。

計(jì)算公式[18]:E(%)=(10-1/slope-1)×100

1.2.6 熔解曲線制作 1.2.4擴(kuò)增程序中40個(gè)循環(huán)結(jié)束后,從65 ℃每5 s升高0.5 ℃直至95 ℃,此中每階段采集熒光信號(hào),最后以溫度為橫坐標(biāo),熒光值變化速度為縱坐標(biāo)繪制熔解曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excle繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算測(cè)定結(jié)果,Originpro 8.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率見(jiàn)表4,110%≥擴(kuò)增效率(E)≥90%,R2≥0.98,均符合qPCR檢測(cè)基本要求[18-19]。同時(shí)樣品中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的CT值均在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定質(zhì)粒濃度范圍內(nèi),表明其測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)表Table 4 Standard curve for quantification of Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli

2.2 回收率分析

目標(biāo)菌回收率和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、樣品、加標(biāo)樣品濃度如表5所示。各目標(biāo)菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；厥章示?0%～100%范圍內(nèi),表明1.2.2中DNA提取純化方法具有較高準(zhǔn)確性,可用于對(duì)泡菜液樣品進(jìn)行處理。

表5 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR的加標(biāo)回收率檢測(cè)Table 5 Standard Recovery of qPCR of the Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli

2.3 熔解曲線分析

熔解曲線見(jiàn)圖1，植物乳桿菌在82.5 ℃、芽孢桿菌屬在88.5 ℃、葡萄球菌屬在87 ℃、大腸埃希氏菌在87 ℃出現(xiàn)僅有的單峰,說(shuō)明擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有引物二聚體和非特異產(chǎn)物生成,擴(kuò)增效果特異性強(qiáng)。

圖1 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR熔解曲線Fig.1 Melting curves of qPCR of Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli 注：A：植物乳桿菌；B：芽孢桿菌屬；C：葡萄球菌屬；D：大腸埃希氏菌，圖2同。

2.4 泡結(jié)球甘藍(lán)發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的qPCR分析

綜上所述,此次實(shí)驗(yàn)建立的qPCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠,可用于對(duì)泡菜液樣品植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的定量檢測(cè)。采用此方法檢測(cè)泡菜發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的變化規(guī)律,結(jié)果如圖2所示。

圖2 泡菜液中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌基因拷貝數(shù)變化Fig.2 Gene copy number change of Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli during the fermentation process of pickled cabbage

如圖2所示,泡菜在自然發(fā)酵過(guò)程中,植物乳桿菌和芽孢桿菌屬基因拷貝數(shù)在前期呈上升趨勢(shì),分別在5 d達(dá)到峰值(4.14±0.38)×109copies/mL和在3 d達(dá)到峰值(7.64±2.42)×109,隨后其基因拷貝數(shù)一直穩(wěn)定在這個(gè)數(shù)量級(jí);葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌基因拷貝數(shù)變化趨勢(shì)基本一致,均為前期上升達(dá)到峰值后穩(wěn)步下降;葡萄球菌屬在3 d達(dá)到峰值(2.62±0.21)×105copies/mL;大腸埃希氏菌在5 d達(dá)到峰值(2.93±0.84)×1012copies/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了泡菜中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的qPCR快速定量檢測(cè)方法,并將其應(yīng)用到泡菜樣品的檢測(cè)中,標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.98,擴(kuò)增效率90%≤E≤110%,樣品加標(biāo)回收率在80%～100%的范圍內(nèi),符合qPCR基本檢測(cè)要求;熔解曲線僅出現(xiàn)單峰,擴(kuò)增特異性強(qiáng),無(wú)非特異性產(chǎn)物生成。采用此方法對(duì)泡白菜自然發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌進(jìn)行定量檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示泡菜液中植物乳桿菌和芽孢桿菌屬基因拷貝數(shù)在前期呈上升趨勢(shì),分別在5 d達(dá)到峰值(4.14±0.38)×109copies/mL和在3 d達(dá)到峰值(7.64±2.42)×109,隨后其基因拷貝數(shù)一直穩(wěn)定在這個(gè)數(shù)量級(jí);葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌基因拷貝數(shù)變化趨勢(shì)基本一致,均為前期上升達(dá)到峰值后穩(wěn)步下降;葡萄球菌屬在3 d達(dá)到峰值(2.62±0.21)×105copies/mL;大腸埃希氏菌在5 d達(dá)到峰值(2.93±0.84)×1012copies/mL。在泡菜發(fā)酵前期大腸埃希氏菌處于優(yōu)勢(shì)地位,隨著發(fā)酵的進(jìn)行植物乳桿菌和芽孢桿菌屬數(shù)量漸漸增長(zhǎng),是發(fā)酵中后期的優(yōu)勢(shì)菌;葡萄球菌在泡菜發(fā)酵各過(guò)程中含量相對(duì)較低。

在不同細(xì)菌細(xì)胞中16S rDNA基因片段拷貝數(shù)一般為1～15個(gè)[22],取其中間值7.5個(gè)/細(xì)胞,可大致計(jì)算出本研究樣品中細(xì)菌數(shù)量。關(guān)于自然發(fā)酵泡菜中微生物動(dòng)態(tài)變化現(xiàn)已有大量實(shí)驗(yàn)報(bào)道,多利用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行微生物數(shù)量檢測(cè),本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與文獻(xiàn)中通過(guò)傳統(tǒng)方法檢測(cè)的泡菜自然發(fā)酵結(jié)果[23-34]相對(duì)比,植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌在自然發(fā)酵泡菜中動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相符合,但峰值出現(xiàn)時(shí)間滯后,且所得計(jì)數(shù)結(jié)果比傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)高?？赡苁且?yàn)閝PCR是通過(guò)檢測(cè)DNA拷貝濃度來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量,沒(méi)有區(qū)分活菌或死菌,而傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法只針對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù);泡菜發(fā)酵過(guò)程中,微生物死亡后還未被分解的DNA,在qPCR檢測(cè)中與熒光染料相結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)從而被定量,因此導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)果相比較存在一定的差異。故下一步研究?jī)?nèi)容將圍繞如何優(yōu)化此方法縮小上述差異開(kāi)展。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法,如平板計(jì)數(shù)法人為操作誤差大,靈敏度低,用時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)基選擇性和不可培養(yǎng)微生物局限的影響,自然環(huán)境中可培養(yǎng)微生物僅占環(huán)境中微生物總數(shù)的0.1%～1%[35];PCR-DGGE和高通量測(cè)序等免培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、只能進(jìn)行相對(duì)定量。利用qPCR技術(shù)對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物進(jìn)行分子層面的定量檢測(cè),則克服了這些弊端,可以更快速準(zhǔn)確地定量檢測(cè)泡菜中微生物,對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行更好的跟蹤監(jiān)控,為泡菜發(fā)酵質(zhì)量的快速判定以及深入了解、控制泡菜發(fā)酵過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

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