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(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006; 2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部,廣東廣州 510010; 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州 510405)

紫果西番蓮(PassifloraedulisSims)多為草本或木質(zhì)藤本多年生植物,《云南中藥資源名錄》中有收載,其根、藤、花、果可入藥,具有活血止痛、清熱止咳等功效[1]。西番蓮果皮占整果質(zhì)量的45%～55%[2],若對(duì)果皮資源進(jìn)行有效利用,將極大減少資源的浪費(fèi)。果膠多糖是一種高價(jià)值的功能性食品添加劑,常被用作凝膠劑和穩(wěn)定劑。研究發(fā)現(xiàn)果膠多糖在抗癌、重金屬吸附等方面有明顯作用[3]。

果膠多糖色澤深、雜質(zhì)多,不利于作為功能性產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)與利用,通常需進(jìn)行脫色處理。目前常用多糖脫色的方法有活性炭吸附、雙氧水法、樹脂法等[4]。張豐進(jìn)等[5]研究發(fā)現(xiàn)紫果西番蓮果皮色素主要是陰離子型分子,活性炭吸附脫色效果遠(yuǎn)低于樹脂法,不宜進(jìn)行果膠多糖脫色處理。雙氧水法是工業(yè)化生產(chǎn)中常用方法,雖然其脫色效果良好,但易造成多糖的氧化損失。樹脂因具有吸附力較高、結(jié)構(gòu)破壞力小、可重復(fù)利用的特點(diǎn)而被廣泛使用。本研究通過靜態(tài)吸附法從六種樹脂中篩選出對(duì)果膠多糖最佳脫色效果的聚酰胺樹脂,以進(jìn)樣量、流速及pH為自變量,以半乳糖醛酸保留率和脫色率為響應(yīng)值,運(yùn)用響應(yīng)面分析法,對(duì)該樹脂的脫色工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紫果西番蓮果皮廣東省梅州市五華縣;D301R陰離子交換樹脂、AB-8、NKA-9、X-5大孔吸附樹脂、001×7陽(yáng)離子交換樹脂、聚酰胺樹脂廣州市齊云生物科技有限公司;半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)G250國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白HyClone公司;濃硫酸、磷酸、氫氧化鈉、鹽酸分析純。

ZHWY-200B恒溫?fù)u床上海智城分析儀器制造有限公司;PHS-3D型pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;YPJ-337紫外可見光分光光度計(jì)北京萊伯泰儀器有限公司;BP210S型分析天平sartorius公司;HH-2恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司;1.5 cm×30 cm層析柱上海達(dá)豐玻璃儀器廠。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紫果西番蓮果膠多糖的制備參照陳穎珊等[6]采用混合酸法提取果膠多糖,以30%檸檬酸鹽酸混合溶液(30%檸檬酸∶鹽酸=1∶2,V/V),料液比1∶45 (w/v),65 ℃條件下提取3次,每次1 h。定性濾紙抽濾,合并濾液,即得果膠多糖提取液,備用。

1.2.2脫色率測(cè)定取1 mL果膠多糖液,用5 mL蒸餾水稀釋,混勻后分別于380、400、450 nm處測(cè)定,取平均吸光度值A(chǔ),脫色率計(jì)算公式為:脫色率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

1.2.3半乳糖醛酸保留率的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考陳穎珊等[6]的方法。在528 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以半乳糖醛酸含量橫坐標(biāo),以吸光度值縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程y=0.0049x-0.0054,R2=0.9991。

采用咔唑比色法[7]測(cè)定多糖溶液脫色前后半乳糖醛酸含量,于525 nm處測(cè)定吸光度A值,保留率計(jì)算式為:半乳糖醛酸保留率(%)=A脫色后/A脫色前×100

1.2.4蛋白質(zhì)脫除率的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線:取6支試管,編號(hào)1、2、3、4、5、6,分別依次加入0、20、40、60、80、100 μg/mL牛血清白蛋白溶液,蒸餾水補(bǔ)足至1 mL,各加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混勻,靜置2 min后于595 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo),以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=0.0072x+0.0069,R2=0.9983。

采用考馬斯亮藍(lán)法[8]測(cè)定多糖溶液脫色前后蛋白質(zhì)含量,于595 nm處測(cè)定吸光度A值,脫除率計(jì)算公式為:蛋白質(zhì)脫除率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

1.2.5樹脂的預(yù)處理大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h,并以無水乙醇洗脫至無色,蒸餾水洗至無醇味。陽(yáng)離子樹脂采用蒸餾水浸泡24 h,蒸餾水洗至澄清,過濾后用1 mol/L NaOH溶液浸泡24 h,蒸餾水洗至中性,過濾,用1 mol/L HCl溶液浸泡24 h,蒸餾水洗至中性。聚酰胺樹脂用90%～95%乙醇浸泡1 h,裝柱。繼續(xù)用乙醇洗脫至洗脫液透明,次用2～2.5倍體積的5% NaOH、1倍的體積蒸餾水、2～2.5倍體積10%醋酸水溶液洗脫,最后用蒸餾水洗至pH中性。

1.2.6靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)D301R、AB-8、NKA-9、X-5、001×7、聚酰胺共六種樹脂預(yù)處理后,分別各稱取2 g放入100 mL具塞錐形瓶中,分別加入60 mL備好的5 mg/mL果膠多糖提取液,室溫下100 r/min,恒溫振蕩0.5、1、1.5、2、3、4 h后取上清液2 mL,計(jì)算其脫色率、半乳糖醛酸保留率以及蛋白脫除率,以確定最佳樹脂用于動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

1.2.7聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1進(jìn)樣量對(duì)脫色率、半乳糖醛酸保留率影響樹脂裝柱12 cm(BV=21 mL),裝柱平衡后,調(diào)節(jié)果膠多糖液pH3.0,分別以1、2、3、4、5 BV進(jìn)樣,迅速調(diào)節(jié)流速3 BV/h,然后用0.25 BV蒸餾水沖洗。過柱液與洗液合并,檢測(cè)脫色率及半乳糖醛酸保留率。

1.2.7.2流速對(duì)脫色率、半乳糖醛酸保留率影響樹脂裝柱12 cm,裝柱平衡后,調(diào)節(jié)果膠多糖液pH3.0,以4 BV進(jìn)樣,迅速調(diào)節(jié)流速1、2、3、6、9 BV/h,然后用0.25 BV蒸餾水沖洗。過柱液與洗液合并,檢測(cè)脫色率及半乳糖醛酸保留率。

1.2.7.3pH對(duì)脫色率、半乳糖醛酸保留率影響樹脂裝柱12 cm,裝柱平衡后,調(diào)節(jié)果膠多糖液pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,以4 BV進(jìn)樣,迅速調(diào)節(jié)流速3 BV/h,然后用0.25 BV蒸餾水沖洗。過柱液與洗液合并,檢測(cè)脫色率及半乳糖醛酸保留率。

1.2.8聚酰胺樹脂脫色工藝響應(yīng)面優(yōu)化以Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理為根據(jù),以上樣量、體積流速、pH為自變量,以半乳糖醛酸保留率和脫色率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析方法,因素水平見表1。

表1　脫色工藝響應(yīng)面因素水平表Table 1　Factors and levels of response surface for decolorization technology

表2　六種不同型號(hào)樹脂脫色率、半乳糖醛酸保留率、蛋白質(zhì)脫除率結(jié)果Table 2　Results on decolorization rate,galacturonic acid retention rate,deproteinization rate by six different resins

2　結(jié)果與分析

2.1　靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

有研究表明聚酰胺樹脂是由酰胺聚合而成的高分子聚合物,通過氫鍵吸附溶液中的陰離子,如酚類、黃酮類化合物的酚羥基,或醌類、脂肪羧酸的羰基[9]。通過靜態(tài)吸附模型,分別以脫色率、半乳糖醛酸保留率、蛋白質(zhì)脫除率為考察指標(biāo),六種不同型號(hào)樹脂結(jié)果見表2,聚酰胺脫色效果最佳,選擇其進(jìn)行進(jìn)一步的脫色工藝優(yōu)化。

2.2　聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1進(jìn)樣量對(duì)脫色率和半乳糖醛酸保留率的影響以半乳糖醛酸保留率和脫色率為指標(biāo),考察聚酰胺樹脂有效色素吸附量,以確定最佳進(jìn)樣量。圖1表明,當(dāng)進(jìn)樣量由1 BV增大到5 BV時(shí),半乳糖醛酸保留率逐漸增加,而脫色率則逐漸減少。在進(jìn)樣量為4 BV時(shí),半乳糖醛酸保留率超過80%以上,呈趨于飽和狀態(tài),脫色率也保持50%以上,而4 BV過后脫色率則快速下降,說明4 BV為聚酰胺動(dòng)態(tài)吸附最佳進(jìn)樣量。同時(shí)也表明進(jìn)樣量4BV時(shí)色素吸附量以達(dá)到飽和。

圖1　進(jìn)樣量對(duì)脫色率和半乳糖醛酸保留率的影響Fig.1　Effect of injection volume on decolorization rate and galacturonic acid retention rate

2.2.2流速對(duì)脫色率和半乳糖醛酸保留率的影響由圖2可知,當(dāng)流速由1 BV/h增大至9 BV/h時(shí),半乳糖醛酸保留率先緩慢增大后緩慢減少,脫色率則先減少后緩慢增大,說明聚酰胺樹脂對(duì)多糖出現(xiàn)反復(fù)吸附和解吸過程。在流速為6 BV/h時(shí)有接近85%半乳糖醛酸保留率,但其脫色率低于50%,說明流速過快可能導(dǎo)致色素分子未能與樹脂結(jié)合;而在流速為3 BV/h時(shí),半乳糖醛酸保留率為84%,且脫色率超過50%,脫色效果顯著增強(qiáng),因此3 BV/h為最佳流速。

圖2　流速對(duì)脫色率和半乳糖醛酸保留率的影響Fig.2　Effect of flow rates on decolorization rate and galacturonic acid retention rate

2.2.3pH對(duì)脫色率和半乳糖醛酸保留率的影響由圖3可知,隨著糖液pH從2.0增大到6.0,半乳糖醛酸保留率先逐漸增加后快速減少,而脫色率變化不明顯。當(dāng)pH為4.0時(shí),半乳糖醛酸保留率為85%,脫色率超過50%,此時(shí)的pH為最佳選擇。

圖3　pH對(duì)脫色率和半乳糖醛酸保留率的影響Fig.3　Effect of pH on decolorization rate and galacturonic acid retention rate

2.3　聚酰胺樹脂脫色工藝響應(yīng)面優(yōu)化

通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化聚酰胺樹脂動(dòng)態(tài)吸附進(jìn)樣量、流速和pH最佳參數(shù),以獲得高脫色率和高半乳糖醛酸保留率的脫色工藝。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)和RSA程序?qū)?7組響應(yīng)值作多元回歸擬合及方差分析見表3。

注：p<0.05顯著,用*表示;p<0.01極顯著,用**表示;表5同。

表3　聚酰胺樹脂脫色工藝響應(yīng)面分析與結(jié)果Table 3　Response surface analysis and results of polyamide resin decolorization technology

2.3.1響應(yīng)值為脫色率的回歸擬合與響應(yīng)面分析由表4可知,模型極顯著(p<0.01);失擬項(xiàng)p=0.4309>0.05不顯著,說明模型可靠;R2為0.9787說明脫色率有97.87%的變化來自所選自變量,該模型擬合度良好;信噪比大于4說明該模型信號(hào)很強(qiáng)。綜上所述,該實(shí)驗(yàn)方法模擬真實(shí)實(shí)驗(yàn)可行。方程中A、B、C均為極顯著性因素,說明各因素對(duì)脫色率的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系。三個(gè)因素對(duì)多糖脫色率影響的順序依次是:進(jìn)樣量(A)>流速(B)>pH(C)。進(jìn)樣量(A)、流速(B)、pH(C)這三個(gè)因素與脫色率之間的二次多項(xiàng)回歸方程為:脫色率(%)=51.6-3.26A-1.84B-0.79C-0.35AB+0.53 AC+0.49BC-0.50A2-0.65B2-0.28C2。

圖4～圖6是根據(jù)回歸分析結(jié)果作出的響應(yīng)面圖,可直觀反映各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖4和5可看出,不同流速和進(jìn)樣量、pH和進(jìn)樣量分別對(duì)曲線最高點(diǎn)影響較小,說明兩因素?zé)o顯著交互作用。圖5曲面比圖4彎曲,說明兩者的交互作用比流速和進(jìn)樣量間的大,而圖6曲面較陡,表明pH和流速交互作用相對(duì)明顯,方差分析佐證交互關(guān)系不顯著。因此,進(jìn)樣量、流速、pH三因素之間無顯著的相互作用。

圖4　流速和進(jìn)樣量對(duì)脫色率的影響 Fig.4　Effect of injection volume and flow rate on decolorization rate

圖5　pH和進(jìn)樣量對(duì)脫色率的影響Fig.5　Effect of pH and injection volume on decolorization rate

表5　半乳糖醛酸保留率為響應(yīng)值方差分析表Table 5　Variance analysis of response value for galacturonic acid retention rate

圖6　pH和流速對(duì)脫色率的影響Fig.6　Effect of pH and flow rate on decolorization rate

2.3.2以半乳糖醛酸保留率為響應(yīng)值的回歸擬合與響應(yīng)面分析由表5可知,方差分析表明模型極顯著(p<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(p=0.8968>0.05),說明模型可靠;R2為0.9688說明半乳糖醛酸保留率有96.88%的變化來自所選自變量;信噪比>4說明該模型信號(hào)很強(qiáng),綜上所述,該模型可真實(shí)地模擬實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況。結(jié)果表明,A、B、C、AC均為極顯著性因素,C2為顯著性因素,說明各因素對(duì)半乳糖醛酸保留率的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系。各因素對(duì)半乳糖醛酸保留率的影響依次為:進(jìn)樣量(A)>流速(B)>pH(C)。進(jìn)樣量(A)、流速(B)、pH(C)這三個(gè)因素與半乳糖醛酸保留率的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y(%)=88.86+2.87A+2.19B-1.87C-0.39AB+1.67AC+0.66BC-0.48A2-0.39B2-1.18C2。

由圖7可以看出,曲面平滑,表明流速和進(jìn)樣量?jī)蓚€(gè)因素不存在明顯的交互作用。圖8中曲面陡峭,進(jìn)樣量對(duì)pH曲線最高點(diǎn)影響小,而pH對(duì)進(jìn)樣量曲線最高點(diǎn)影響較大,說明兩者的交互作用較大。圖9中pH和流速之間的交互作用比圖7大,曲面較陡,但不顯著。綜上所述,三者間僅有pH和進(jìn)樣量間存在交互作用,表明改變pH需適當(dāng)調(diào)整進(jìn)樣量才可獲得理想半乳糖醛酸保留率。

圖7　流速與進(jìn)樣量對(duì)半乳糖醛酸保留率的影響Fig.7　Effect of flow rate and injection volume on galacturonic acid retention rate

圖8　pH與進(jìn)樣量對(duì)半乳糖醛酸保留率的影響Fig.8　Effect of pH and injection volume on galacturonic acid retention rate

圖9　pH與流速對(duì)半乳糖醛酸保留率的影響Fig.9　Effect of pH and flow rate on galacturonic acid retention rate

2.4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取西番蓮果皮5份,每次15.0 g,按照進(jìn)樣量3.5 BV,流速3 BV/h,pH3.5的脫色工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證,此時(shí)脫色率預(yù)期值為53.41%,半乳糖醛酸保留率預(yù)期值為87.2%。5次實(shí)驗(yàn)得平均果膠多糖脫色率為52.78%,實(shí)際值達(dá)理論預(yù)測(cè)值的98.82%;得半乳糖醛酸保留率為85.62%,實(shí)際值達(dá)理論預(yù)側(cè)值的98.19%,說明該優(yōu)化方法可行。

3　結(jié)論

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)聚酰胺樹脂具有良好的脫色率、半乳糖醛酸保留率及蛋白質(zhì)脫除率,分別為49.69%、87.56%、71.53%。本研究中表明聚酰胺樹脂的脫色效果優(yōu)于D301R陰離子樹脂、001×7陽(yáng)離子樹脂和X-5、AB-8、NKA-9三種大孔吸附樹脂,說明多糖提取液中的色素分子結(jié)構(gòu)可能與黃酮、酚類化相似。綜合回歸模型分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最終確定聚酰胺樹脂對(duì)紫果西番蓮果膠多糖的最佳脫色工藝參數(shù)為:進(jìn)樣量3.5 BV,流速3 BV/h,pH3.5,在此條件下,半乳糖醛酸保留率為85.62%,脫色率為52.78%,分別達(dá)理論預(yù)測(cè)值的98.82%和98.19%,驗(yàn)證了數(shù)學(xué)模型的有效性,具有一定的實(shí)際生產(chǎn)意義。

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