李 張，徐志榮，婁佳蘭，譚小林，劉怡婷，上官桃鳳，魏賽金

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防褐化劑對南方紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響

李 張，徐志榮，婁佳蘭，譚小林，劉怡婷，上官桃鳳，魏賽金*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045）

研究了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(AC)、抗壞血酸(VC)、檸檬酸(CA)和硫代硫酸鈉(hypo) 5種防褐化劑對南方紅豆杉愈傷組織的生長及褐化情況的影響。測定不同時間愈傷組織中多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性及酚類物質(zhì)含量的變化。結(jié)果表明，PVP對細(xì)胞生長促進效果最好；第20天時hypo處理的PPO活性最低，低于對照78.77%，第15天時VC處理的POD活性最低，低于對照604.92%；第20天時，CA處理的總酚含量最低，低于對照108.82%。所選的5種防褐化劑在降低紅豆杉細(xì)胞褐化均具有一定效果。

南方紅豆杉；愈傷組織；防褐化劑；酚類物質(zhì)；酶活性

南方紅豆杉(var.)又稱紫杉，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬()植物，主要分布于中國南方地區(qū)，是紅豆杉屬中分布最廣、生長最快的一種，為國家一級保護樹種[1]。其含有的紫杉醇屬四環(huán)二萜酰胺類化合物，是一種對治療肺癌、卵巢癌等有特效的抗癌藥物，是當(dāng)前公認(rèn)的廣譜、活性強的一線抗腫瘤藥物[2-3]。傳統(tǒng)獲得紫杉醇的方法主要是從紅豆杉的根皮、莖、葉中來提取，由于提取工藝較為復(fù)雜、設(shè)備投資大、原料缺乏而嚴(yán)重受限，而采用的植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇具有很大潛力[4]。但由于紅豆杉屬植物本身特殊的生物學(xué)特性，在培養(yǎng)過程中組織和細(xì)胞常發(fā)生褐化，輕則影響組織細(xì)胞生長和繁殖，重則導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡，已成為制約這一技術(shù)推廣的最大障礙，所以有效地防止和解決組織培養(yǎng)中的褐化是當(dāng)今研究的熱點[5]。

研究認(rèn)為，酚類物質(zhì)經(jīng)過多種氧化酶如多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）催化后形成醌類物質(zhì)，再通過聚合作用產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織呈褐色，即為褐變[6]。這種褐色物質(zhì)逐漸擴散到培養(yǎng)基中，毒害整個組織并嚴(yán)重影響愈傷組織的生長與代謝，也是一些植物組織培養(yǎng)能否取得成功的決定性因素。褐化發(fā)生與外植體體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)，而酚類化合物種類較多，不同植物類型所含的酚類物質(zhì)種類各不相同，尋找酶促褐變的主要底物能為控制組培褐化提供重要的理論依據(jù)[7]。

本試驗擬通過向培養(yǎng)基添加不同類型的防褐化劑，探究其對已褐化的南方紅豆杉愈傷組織的生長及褐化情況的影響，測定愈傷組織中PPO和POD活性及酚類物質(zhì)含量的變化。旨在為抑制紅豆杉愈傷組織褐化提供一定的科學(xué)依據(jù)，為進一步揭示與褐化相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南方紅豆杉愈傷組織：以南方紅豆杉一年生枝條為外植體經(jīng)誘導(dǎo)后獲得，繼代培養(yǎng)至5代以上[8]； B5培養(yǎng)基：青島海博生物。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 抗氧化劑處理 用不同抗氧化劑處理繼代后的褐化愈傷組織，抗氧化劑為過濾滅菌后的硫代硫酸鈉(hypo)、檸檬酸(CA)、抗壞血酸（VC），濃度分別為100 mg/L，以不添加抗氧化劑為對照。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每隔5 d觀察愈傷組織生長及褐化程度并檢測細(xì)胞中PPO和POD活性及酚類物質(zhì)的含量。

1.2.2 吸附劑處理 分別向固體培養(yǎng)基中加入活性炭(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，濃度分別為0.5 g/L，以不添加吸附劑為對照。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每隔5d觀察愈傷組織生長及褐化程度并檢測細(xì)胞中PPO和POD活性及酚類物質(zhì)的含量。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 細(xì)胞生長指數(shù)的測定 生長指數(shù)=（收獲量–接種量）/接種量×100%

1.3.2 愈傷組織褐變強度測定 觀察愈傷組織的顏色，并按其褐化程度可以將其分為4個等級：1 級：表示沒有褐化，表示符號（–）；2 級：表示輕微褐化，表示符號（+）；3 級：表示褐化嚴(yán)重，表示符號（++）；4 級：表示褐化非常嚴(yán)重，表示符號（+++）。

1.3.3 PPO和POD活性測定 PPO提取與活性測定參照張月玲等[9]方法；POD提取與活性測定參照隋麗等[10]方法。

1.3.4 總酚含量的測定 總酚提?。喝∮鷤M織1 g，加甲醇研磨成勻漿，用甲醇定容10 mL，55 ℃超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后的濾液為待測提取液?？偡雍繙y定方法采用福林酚法[11-12]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，誤差分析采用Duncan新復(fù)極差法；作圖采用Origin 8.5.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同防褐化劑處理對外植體褐化的影響

褐化的愈傷組織(圖1A)經(jīng)防褐化劑處理后，重新長出狀態(tài)較好的愈傷組織(圖1B)。每個處理下的個體差異較大，整體的褐化狀況如表1所示。

表1 第20天愈傷組織褐化程度

圖1 對照與防褐化劑處理愈傷組織生長狀態(tài)

2.2 不同防褐化劑處理對細(xì)胞生長指數(shù)的影響

由圖2A可知與對照相比，5種防褐化劑在不同時期均對褐化細(xì)胞的生長有促進作用，其中以PVP效果最好，在第20天時，PVP的細(xì)胞生長指數(shù)為112.18%，CA為44.20%，VC為40.32%，hypo為39.31%，AC為27.72%，CK為17.83%。

2.3 不同防褐化劑處理對總酚含量的影響

第5天時，PVP和AC處理的總酚含量均高于對照，而hypo、VC、CA處理的胞內(nèi)總酚含量低于對照，隨著時間的增加，PVP處理的總酚含量逐漸低于對照，而AC處理的胞內(nèi)總酚含量仍高于對照。第20天時，CA處理的總酚含量最低，低于對照108.82%，其次為hypo處理，總酚含量低于對照77.50%（圖2B）。

圖2 不同防褐化劑處理對細(xì)胞生長指數(shù)和總酚含量的影響

2.4 不同防褐化劑處理對PPO活性的影響

由圖3A可知，在培養(yǎng)的第5天，PVP和AC處理的PPO活性高于對照，而hypo、VC、CA處理的PPO活性低于對照，hypo處理的PPO活性最低，低于對照166.18%；隨著時間的增長，PVP和AC處理的PPO酶活性逐漸低于對照酶活性，hypo、VC、CA處理的PPO酶活性呈先增后減的趨勢；15 d以后，所有處理的PPO活性均低于對照，第20天時，hypo處理的PPO活性最低，低于對照78.77%。

2.5 不同防褐化劑處理對POD活性的影響

在培養(yǎng)的第5天，對照POD活性均高于防褐化劑處理，PVP、AC處理的POD活性高于hypo、VC、CA處理的POD活性；隨著時間的增長，PVP和AC處理的POD酶活性逐漸低于對照酶活性，hypo、VC、CA處理的POD酶活性呈先減后增的趨勢；第15天時，所有處理的POD活性均低于對照，VC處理的POD活性最低，低于對照604.92%（圖3B）。

圖3 不同防褐化劑處理對PPO和POD活性的影響

3 討 論

褐化是復(fù)雜的生化過程，就是組織內(nèi)或傷口處分泌的酚類化合物在多酚氧化酶等作用下發(fā)生的氧化反應(yīng)從而形成了褐色的醌類物質(zhì)，酶促褐化必須具備酶、底物和氧3個條件[13-14]。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起酶系統(tǒng)失活，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞代謝紊亂生長受阻[15]。

葉梅、羅曉芳等[16-17]的研究表明，多酚氧化酶的活性與組織培養(yǎng)材料的褐變不呈正相關(guān)，但酚類物質(zhì)的總含量與褐變有一定的關(guān)系。與PPO相比，POD參與酶促褐化反應(yīng)的作用非常有限[18]。印芳等[19]在蝴蝶蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，褐化程度高的品種，總酚含量也較高。

防褐劑一般可分為抗氧化劑和吸收劑兩大類，PVP和AC作為吸附防褐化劑，對褐化細(xì)胞的生長有促進作用，其對PPO和POD酶活抑制效果一般，能降低的細(xì)胞中總酚含量，其可能的作用機制是防褐化吸附劑通過降低培養(yǎng)基中總酚含量來達到防褐化效果。hypo、VC、CA作為抗氧化防褐化劑，能明顯抑制PPO和POD酶活，這是因為抗氧化劑防褐化劑能與酶發(fā)生竟?fàn)幮越Y(jié)合的，從而降低酶活，降低酶促褐化，減少有害物質(zhì)對細(xì)胞的毒害。

本試驗所選的5種防褐化劑在降低紅豆杉細(xì)胞褐化均具有一定效果。從抑制PPO和POD酶活性效果來看，抗氧化防褐化劑效果好于吸附防褐化劑；添加抗氧化防褐化劑的紅豆杉細(xì)胞中總酚含量低于吸附防褐化劑?？寡趸篮只瘎┲?，綜合比較，hypo抗褐化效果最好，其原因有可能是加入VC和CA會使培養(yǎng)基pH值下降，影響細(xì)胞生長代謝。所以培養(yǎng)基中添加防褐化劑濃度應(yīng)該控制在即具有顯著防褐化效果，又不影響外植體的生長分裂和分化。

綜上所述，向培養(yǎng)基中加入防褐化劑，可減輕愈傷組織褐化，細(xì)胞酚類物質(zhì)含量減少，PPO和POD活性下降。因此，通過降低愈傷組織中總酚含量和PPO、POD活性來抑制褐化在理論上是可行的。在后續(xù)的研究中，需要尋找并調(diào)節(jié)與總酚含量直接相關(guān)的酶、PPO、POD及其基因的表達，從而達到抑制紅豆杉愈傷組織褐化的目的。

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Effects of Browning Antagonists on Callus Browning and Its Related Substance Contents in

LI Zhang, XU Zhi-rong, LOU Jia-lan, TAN Xiao-lin, LIU Yi-ting, SHANGGUAN Tao-feng, WEI Sai-jin*

(College of Biological Science and Engineering/Jiangxi Agricultural Microbial Resource Development and Utilization Engineering Lab, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

var.callus were selected as suitable materials and treated with a variety of different browning antagonists, including polyvinyl pyrrolidone (PVP), activated carbon (AC) , vitamin C (VC), citric acid (CA) and sodium thiosulfate (hypo), and the effects of them on the growth and browning ofvar.callus were assessed. The changes in the activity of polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) and the content of phenolic acids in the callus in different time were measured. The results showed that PVP had the best effect on cell growth; Activities of PPO were reduced by 78.77% at their lowest levels under treatments with hypo in the 20th day, and activities of POD were reduced by 604.92% at their lowest levels under treatments with VC in the 15th day; Total phenolic content was decreased by 108.82% at their lowest levels under treatments with CA in the 20th day. SO, 5 browning antagonists were effective to reduce callus browning invar.callus.

var.; callus; browning antagonists; phenolic compounds;enzyme activity

Q942.5

A

2095-3704（2018）01-0069-05

2018-01-26

江西省科技計劃項目（20133BBG70090）和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（201710410067）

李張（1993—），男，碩士生，主要從事植物生理學(xué)研究，905092083@qq.com；

通信作者：魏賽金，教授，博士，weisaijin@126.com。

李張, 徐志榮, 婁佳蘭, 等. 防褐化劑對南方紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(1): 69-73.