文/周 穎　黃 銳

（中墾華山牧乳業(yè)有限公司）

牛乳中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有多種氨基酸、維生素、微量元素等，是微生物繁殖的理想環(huán)境，因此殺菌是生乳加工過程中的重要步驟之一[1]。然而乳中含有多種熱敏性的活性物質(zhì)，過高的殺菌溫度必然導(dǎo)致乳中的營養(yǎng)物質(zhì)損失。所以生乳的熱處理應(yīng)包含2個(gè)目的：一是保證產(chǎn)品的安全性；二是使產(chǎn)品更健康。糠氨酸是衡量生乳熱處理程度的常用指標(biāo)，加熱程度越高，糠氨酸含量越高。生乳中最重要的活性蛋白包含乳過氧化物酶、乳鐵蛋白和α-乳白蛋白，它們具有多種功能特性和生物活性，研究最為廣泛和深入[2～4]。近年來，巴氏殺菌乳受到消費(fèi)者的青睞，它不僅保證了產(chǎn)品中的活性物質(zhì)，又能有效殺死致病菌。然而，不同巴氏殺菌溫度對(duì)乳中成分的影響程度尚且不明確，本文利用利樂殺菌機(jī)對(duì)生乳進(jìn)行不同溫度的巴氏殺菌，通過檢測初步了解菌落總數(shù)、糠氨酸含量、過氧化物酶活性以及乳鐵含量的變化情況，為巴氏殺菌溫度提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min。

1.2　主要試劑

乳鐵蛋白試劑盒，荷蘭EuroProxima公司；糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（肽純度72.6%），法國Polypeptide公司；過氧化酶試劑盒，意大利CDR FoodLab。

1.3　儀器與設(shè)備

1260Infinity液相色譜儀，美國Agilent；Atlantis?dC18色譜柱，美國Waters；Kjeltec 8400自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS；SLB222CDR FoodLab Touch analyzer，意大利CDR FoodLab；KQ5200V超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSP-800生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；YXQ.WF32A臥式蒸汽滅菌器，四川射洪通用醫(yī)療器械有限公司；SC/DT400J2冷藏柜，黃石東貝制冷有限公司。

1.4　方法

1.4.1菌落總數(shù)測定

按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》的要求進(jìn)行檢測[5]。

1.4.2糠氨酸含量測定

對(duì)樣品中的糠氨酸含量按照如下步驟進(jìn)行測定[6，7]。

表1　洗脫梯度

1.4.2.1樣品水解液準(zhǔn)備

吸取2.00mL樣品，置于密閉耐熱試管中，加入6.00mL 10.6mol/L鹽酸溶液，混勻。密閉試管置于110℃烘箱中加熱水解12～23h。加熱約1h后，輕輕搖動(dòng)試管。加熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后用濾紙過濾，濾液供測定。

1.4.2.2樣品中蛋白質(zhì)含量測定

稱取2.00mL樣品水解液，按GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》的要求進(jìn)行檢測[8]。

1.4.2.3糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500.0mg/L）：稱取6.89mg糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用3mol/L鹽酸溶液溶解并定容至10mL，即制得500mg/L的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（2.0mg/L）：移取100μL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于25mL容量瓶，用3mol/L鹽酸溶液溶解并定容，即制得2.0mg/L的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2.4液相色譜檢測

移取1.00mL樣品水解液，加入5.00mL的6g/L乙酸銨溶液，混勻，過0.22μm水相濾膜，濾液供上機(jī)測定。

采用Agilent液相色譜儀分析。色譜柱為Atlantis?dC18色譜柱，4.6mm×250mm×5μm粒徑；檢測器為Agilent G7114A紫外檢測器；柱溫32℃；波長280nm；流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B；進(jìn)樣量10μL。洗脫梯度如表1所示。

1.4.2.5糠氨酸含量計(jì)算

糠氨酸含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)F計(jì)，數(shù)值以毫克每百克蛋白質(zhì)（mg/100g蛋白質(zhì)）表示。

式中：At為樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Astd為糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Cstd為糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為mg/L；D為測定時(shí)稀釋倍數(shù)（D=6）；m為樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，單位為g/L。

1.4.3過氧化物酶活性測定

按照過氧化酶試劑盒說明書操作。

1.4.4乳鐵蛋白含量測定

按照乳鐵蛋白試劑盒說明書操作。

1.4.5試驗(yàn)方法

1.4.5.1生乳菌落總數(shù)和過氧化物酶活性的測定。

1.4.5.2通過設(shè)定利樂多功能巴氏殺菌機(jī)參數(shù)，對(duì)生乳分別進(jìn)行72℃、73℃、74℃、75℃和80℃殺菌，殺菌保持時(shí)間一致，分別取樣用于菌落總數(shù)、糠氨酸含量、過氧化物酶活性、乳鐵蛋白含量的檢測。平行試驗(yàn)為4次。

2　結(jié)果與分析

2.1　生乳菌落總數(shù)

各平行試驗(yàn)檢測的生乳菌落總數(shù)如表2所示?？梢钥闯觯糜谠囼?yàn)的生乳菌落總數(shù)指標(biāo)平均值在1.2×103CFU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)2×106CFU/mL，生乳的微生物指標(biāo)決定了巴氏殺菌后樣品的菌落總數(shù)的整體水平。

2.2　不同殺菌溫度下菌落總數(shù)的變化

不同殺菌溫度下菌落總數(shù)變化如圖1所示。可以看出，72℃、73℃的殺菌溫度下，菌落總數(shù)無顯著性差異，在74℃有較明顯的下降趨勢(shì)，而74℃、75℃和80℃的菌落總數(shù)無顯著性差異。但在72～80℃均能達(dá)到較好的巴氏殺菌效果，符合國家巴氏殺菌乳的要求[9]。

2.3　不同殺菌溫度下糠氨酸含量的變化

不同殺菌溫度下糠氨酸含量的變化如圖2所示?？梢钥闯觯楹?2℃殺菌溫度下產(chǎn)品的糠氨酸含量無顯著差異；73℃、74℃、75℃殺菌的糠氨酸含量無顯著性差異；80℃殺菌下糠氨酸含量與其它殺菌溫度的產(chǎn)品有顯著性差異。

表2　生乳菌落總數(shù)

圖 1不同殺菌溫度下菌落總數(shù)變化

圖 2不同殺菌溫度下糠氨酸含量的變化

圖 3不同殺菌溫度下過氧化物酶活性的變化

圖 4不同殺菌溫度下乳鐵蛋白含量的變化

2.4　不同殺菌溫度下過氧化物酶活性的變化

不同殺菌溫度下過氧化物酶活性的變化如圖3?？梢钥闯?，生乳，在72℃、73℃、74℃、75℃、80℃殺菌后，過氧化物酶活性有顯著性差異，在80℃時(shí)活性僅為126U/L。這說明過氧化物酶活性對(duì)溫度較敏感。相關(guān)研究表明[10]，乳的過氧化物酶在85℃的殺菌溫度下失活，與本文研究相一致。

2.5　不同殺菌溫度下乳鐵蛋白含量的變化

不同殺菌溫度下乳鐵蛋白含量的變化如圖4所示?？梢钥闯?，72℃、73℃、74℃、75℃殺菌的乳鐵蛋白含量無顯著性差異，在80℃時(shí)有顯著性下降。

3　小結(jié)

近年來，對(duì)乳鐵蛋白和乳過氧化物酶功能特性的研究不斷深入，乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合蛋白，具有多種功能特性，包括抑菌、抗氧化、抗炎癥、抑制癌細(xì)胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移等[11，12]；大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，乳鐵蛋白及其衍生肽能夠抑制腫瘤的生長[13，14]，同時(shí)不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生任何副作用[15]。乳過氧化物酶對(duì)生乳有重要的保護(hù)作用，具有廣泛的抑菌效果[16]，它的抗氧化作用能夠降解致癌物質(zhì)[17，18]。

巴氏殺菌溫度對(duì)產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和安全性有重要的影響，本文研究表明：72℃、73℃殺菌后，菌落總數(shù)無顯著差異，74℃、75℃、80℃有顯著性下降，但均能到達(dá)很好的殺菌效果；隨著加熱溫度的升高，糠氨酸含量有顯著性增加，維持在6mg/100g蛋白質(zhì)以下；過氧化物酶活性隨著殺菌溫度的升高而顯著性下降，在80℃時(shí)僅為126U/L；72℃、73℃、74℃和75℃的殺菌后，乳鐵蛋白含量無顯著性變化，而在80℃時(shí)有顯著性下降，最低值在24mg/kg。研究表明，過氧化物酶活性對(duì)溫度極為敏感，可作為殺菌溫度對(duì)乳中活性物質(zhì)影響的參考依據(jù)，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的指導(dǎo)作用。C

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