劉樹文， 牟丹敏

(貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550018)

擬球狀念珠藻(NostocsphaeroidesKützing)別稱葛仙米，是一種生長在我國極少數(shù)山區(qū)水稻田中的念珠藻，屬多細(xì)胞藍(lán)藻，具有較高的食用價(jià)值和食療保健的藥用價(jià)值[1-2]。葛仙米因晉朝的道教倫理學(xué)家、醫(yī)學(xué)家、煉丹家葛洪的名字及其經(jīng)歷而命名，是中國出口的一種傳統(tǒng)珍貴野生食品，在《本草綱目》《本草綱目拾遺》中對(duì)其均有記載[1-3]。近年來由于農(nóng)民施用化肥及除草劑等農(nóng)藥，改變了葛仙米賴以生存的生長環(huán)境，導(dǎo)致葛仙米產(chǎn)量急劇降低，甚至有絕跡的可能[4]，這些都將影響這一珍貴野生食品的開發(fā)和利用。為了讓更多的人品嘗到這種珍稀藻類，首先應(yīng)該采取適當(dāng)?shù)拇胧┍Ｗo(hù)好葛仙米的野生資源，使其脫離瀕臨滅絕的危險(xiǎn)；同時(shí)進(jìn)行開發(fā)研究，最終走廣泛和深層次的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)葛仙米的道路[1-2]。近年來，一些科研工作者開展了關(guān)于葛仙米的人工養(yǎng)殖研究。

光照是影響藻類光合作用效率的重要環(huán)境條件，在藻類人工培養(yǎng)過程中通常需要合理的光照度和光照周期。然而，許多研究表明，不同顏色的光(光質(zhì))對(duì)藻類的生長及生理也會(huì)產(chǎn)生較大的影響。Aidar等發(fā)現(xiàn)微小環(huán)藻(Cyclotellacaspia)在藍(lán)光下生長速率最高，而亞心形扁藻(Tetraselmisgracilis)在紅光下生長較快[5]；Wang等發(fā)現(xiàn)紅光能夠提高鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)的比生長速率，而該藻在藍(lán)光下光量子轉(zhuǎn)換成生物量的效率最低[6]；Das等研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光能夠提高微擬球藻(Nannochloropsissp.)的比生長速率，而紅光下微擬球藻的比生長速率最低[7]；毛安君采用單色LED光源和熒光燈從效率和速率2個(gè)角度研究了光源光譜對(duì)海生小球藻(Chlorellavulgari)和等鞭金藻(Isochrysis)生長的影響，發(fā)現(xiàn)連續(xù)光譜能夠促進(jìn)最大生長率提高，藍(lán)光促進(jìn)生長的效率較高，兩者組合能夠較好地兼顧效率和速率[8]。因此，光質(zhì)對(duì)人工培養(yǎng)的不同藻類會(huì)產(chǎn)生不同的生理影響。

藍(lán)藻含有葉綠素a(chlorophyll-a，簡稱Chla)、類胡蘿卜素(carotenoids，簡稱Car)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱PC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱PE)和別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)等多種光合色素。葉綠素主要吸收640～660 nm的紅光和430～450 nm的藍(lán)紫光，類胡蘿卜素主要吸收400～500 nm波長的光，PE、PC、APC的最大吸收波長分別為540～570、610～620、650～655 nm[9]。關(guān)于光質(zhì)對(duì)藍(lán)藻葛仙米生理影響的相關(guān)研究較少。本研究通過測定3種不同的光質(zhì)(白光、紅光、藍(lán)光)下葛仙米的比生長速率及各種光合色素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，探討3種不同的光質(zhì)對(duì)葛仙米的生理影響，尋找適合葛仙米人工養(yǎng)殖的光質(zhì)，為葛仙米的規(guī)?；B(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與培養(yǎng)條件

葛仙米采自貴州省岑鞏縣凱本鄉(xiāng)沈家灣村的水稻田中。葛仙米的培養(yǎng)采用BG110培養(yǎng)基，在121 ℃、1.05 kg/cm2條件下滅菌30 min。藻種經(jīng)過勻漿之后，分別接種到9個(gè)高壓滅菌的500 mL錐形瓶中，加入450 mL BG-110培養(yǎng)基，初始接種量為450 μg/mL葉綠素。培養(yǎng)溫度26 ℃，用白光、紅光、藍(lán)光3種不同顏色的LED燈提供不同顏色的光照，3種顏色光的光照度控制在820 lx左右，每種顏色的光照條件設(shè)置3個(gè)重復(fù)。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過濾的無菌空氣，通氣量為300 mL/min。

1.2　生長曲線的制作和比生長速率的測定

在葛仙米的生長的0、2、4、6、8、10 d，于每天12：00在每瓶培養(yǎng)液中分別取1次藻液，藻液體積為10 mL。離心 30 min，倒掉上清液，加入3 mL 95%乙醇，振蕩，放入4 ℃冰箱中過夜。4 000 r/min離心30 min后，取上清液，用分光光度計(jì)測定D665 nm和D649 nm。葉綠素a含量按如下公式計(jì)算[10]：Chla含量(mg/L)=13.95D665 nm-6.88D649 nm。比生長速率的計(jì)算根據(jù)公式：μ=(lnX1-lnX2)/(T10-T0)。式中：X1、X2分別是0、10 d的葉綠素a含量，μg/L；T10、T0分別表示10、0 d。采用Origin 7.0軟件繪制時(shí)間(天)、葉綠素含量(μg/L)的生長曲線圖。

1.3　各種主要光合色素含量的測定

各瓶葛仙米培養(yǎng)的10 d，在培養(yǎng)光照顏色分別為白光、紅光、藍(lán)光的培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，按照“1.2”節(jié)的方法取樣和提取色素，用分光光度計(jì)測定665、649、447 nm波長的吸光度D665 nm、D649 nm、D470 nm。計(jì)算葉綠素a含量。因?yàn)楦鹣擅诪樗{(lán)藻，不含葉綠素b，因此類胡蘿卜素含量計(jì)算依據(jù)以下公式[10]：Car含量=1 000×D470 nm-2.05×Chla含量。

在10 d時(shí)，另在培養(yǎng)光質(zhì)分別為白光、紅光、藍(lán)光的培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min離心30 min，去上清夜，各加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，用分光光度計(jì)測定上清液在562、615、652 nm波長的吸光度D562 nm、D615 nm和D652 nm。藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白的含量根據(jù)Siegelman & Kycia的公式計(jì)算[11]：PC含量(mg/mL)=(D615 nm-0.474D652 nm)/5.34；APC含量(mg/mL)=(D652 nm-0.208D615 nm)/5.09；PE含量(mg/mL)=(D562 nm-2.41PC含量-0.849APC含量)/9.62。

1.4　蛋白質(zhì)含量的測定

各瓶葛仙米培養(yǎng)10 d，按照“1.3”節(jié)提取3種藻膽蛋白的方法提取白光、紅光、藍(lán)光的培養(yǎng)瓶中葛仙米的可溶性蛋白，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定各樣品中蛋白質(zhì)的濃度[10]。

1.5　可溶性糖含量的測定

培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液各取20 mL，4 000 r/min離心 30 min，去上清液，各加入4 mL 蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min 離心30 min，提取得到葛仙米的可溶性糖。取上清液，用蒽酮試劑法測定各樣品中可溶性糖濃度[10]。

1.6　統(tǒng)計(jì)分析

本研究主要采用軟件Origin 7.0、STATISTICA?7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey顯著性檢驗(yàn)(HSD)檢測不同處理間的顯著性水平。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同光質(zhì)條件下葛仙米的生長

圖1表明，葛仙米分別在白光、紅光和藍(lán)光下培養(yǎng)10 d后，以葉綠素a濃度表示的生物量分別增加到第1天的3.83倍、4.98倍及1.91倍。由表1可知，紅光培養(yǎng)葛仙米的比生長速率最大，藍(lán)光培養(yǎng)葛仙米的比生長速率最小，與白光培養(yǎng)葛仙米的比生長速率相比，紅光培養(yǎng)的增加了23.08%，但兩者之間差異不顯著(Tukey’s HSD)；藍(lán)光培養(yǎng)的降低了53.85%，且差異顯著(Tukey`s HSD，P<0.05)。

2.2　不同光質(zhì)條件下葛仙米的光合色素含量和比例的變化

由表2、表3可知，紅光培養(yǎng)的葛仙米PC、Chla、Car含量略高于白光培養(yǎng)的葛仙米，APC、PE含量略低于白光培養(yǎng)的葛仙米，但都沒有顯著差異。藍(lán)光培養(yǎng)的葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量都顯著低于白光和紅光培養(yǎng)的葛仙米(P<0.05)。紅光培養(yǎng)的葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量分別為藍(lán)光培養(yǎng)葛仙米的175%、165%、126%、240%、158%(P<0.05)。

表1　不同光質(zhì)條件下葛仙米的比生長速率

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著。下表同。

表2　不同光質(zhì)條件下葛仙米的PC、APC、PE含量

表3　不同光質(zhì)條件下葛仙米的葉綠素a和類胡蘿卜素的含量

由表4可知，藍(lán)光和白光培養(yǎng)條件下，葛仙米的PC、APC、PE、Car含量與Chla含量的比值分別為紅光培養(yǎng)葛仙米的137%、182%、193%、153%和107%、148%、146%、106%。

表4　不同光質(zhì)條件下葛仙米的PC、APC、PE、Car含量

2.3　不同光質(zhì)條件下葛仙米可溶性蛋白含量的變化

由圖2可知，溶液中可溶性蛋白含量(y)與考馬斯亮藍(lán)染色后的可溶性蛋白溶液在595 nm波長下的吸光度(x)之間的直線方程為y=1.298 4x+0.007 2(r2=0.99)。由圖3可知，藍(lán)光培養(yǎng)葛仙米的可溶性蛋白含量最高，分別為紅光、白光培養(yǎng)葛仙米的189%、161%(P<0.05)。紅光培養(yǎng)葛仙米的可溶性蛋白含量略低于白光培養(yǎng)葛仙米，但無顯著差異。

2.4　不同光質(zhì)條件下葛仙米可溶性糖含量的變化

由圖4可知，溶液中可溶性糖含量(y)與蒽酮試劑染色后的可溶性糖溶液在620 nm波長下的吸光度(x)的直線方程為y=1.569 1x+0.094 1(r2=0.188 2)。由圖5可知，紅光培養(yǎng)葛仙米的可溶性糖含量最高，分別為白光、藍(lán)光培養(yǎng)葛仙米的122%、176%(P<0.05)。紅光培養(yǎng)葛仙米的可溶性糖含量略高于白光培養(yǎng)葛仙米。

3　討論與結(jié)論

不同的光質(zhì)培養(yǎng)條件對(duì)葛仙米的生長產(chǎn)生不同的影響。紅光培養(yǎng)條件下葛仙米的以葉綠素含量表示的總生物量及比生長速率最大，白光次之，藍(lán)光最小，這表明紅光對(duì)葛仙米的生長最有利。Wang等的研究結(jié)果也表明，紅光培養(yǎng)條件下螺旋藻的生長最快[6]，與本研究的結(jié)論一致。然而，Das等研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光能夠提高微擬球藻(Nannochloropsissp.)的比生長速率，而紅光下微擬球藻的比生長速率最低[7]。不同的藻類具有不同的光合色素組成，光合作用過程對(duì)光照顏色的要求也不同，如鈍頂螺旋藻生長需要較低的光照度，而藍(lán)光因?yàn)椴ㄩL較短、能量較高而不利于其生長，相反紅光卻能促進(jìn)鈍頂螺旋藻的生長[12]。

藍(lán)藻的眉藻(Calothrix)和點(diǎn)形念珠藻(Nostocpunctiforme)能通過改變藻細(xì)胞內(nèi)各種光合色素的含量和比例來適應(yīng)不同的光質(zhì)條件，即“補(bǔ)色適應(yīng)”現(xiàn)象[12-14]。本研究的結(jié)論也表明，葛仙米在不同的光質(zhì)培養(yǎng)條件下，各種光合色素的含量及比例發(fā)生變化，以此來適應(yīng)不同的光質(zhì)條件。葛仙米葉綠素a、類胡蘿卜素、藻藍(lán)蛋白的含量大小順序?yàn)榧t光>白光>藍(lán)光。別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白含量大小順序?yàn)榘坠?紅光>藍(lán)光。然而，藍(lán)光雖然抑制了培養(yǎng)液中葛仙米的各種光合色素含量的增加，但在藍(lán)光培養(yǎng)條件下葛仙米的各種藻膽蛋白及類胡蘿卜素與葉綠素含量的比值卻升高。類胡蘿卜素、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白與葉綠素含量的比值大小順序?yàn)樗{(lán)光>白光>紅光。有研究表明，紅光促進(jìn)藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白和葉綠素的合成，抑制藻紅蛋白的合成[15]。

葛仙米可溶性蛋白含量大小順序?yàn)樗{(lán)光>白光>紅光，而葛仙米可溶性糖含量大小順序?yàn)榧t光>白光>藍(lán)光。在紅光下生長的葛仙米光合效率高，能產(chǎn)生更多的光合產(chǎn)物，有利于碳水化合物的積累[15-16]。但藍(lán)光波長短、能量高，容易對(duì)藻類產(chǎn)生光抑制傷害，不利于光合碳固定以及糖類的合成，但有利于可溶性蛋白含量的積累[15-16]。王偉發(fā)現(xiàn)藍(lán)光能夠促進(jìn)中華盒形藻蛋白質(zhì)的合成，而紅光下碳水化合物含量增加[16]，這與本研究的結(jié)論一致。

綜上，紅光有利于葛仙米的快速生長，不同的光質(zhì)影響葛仙米的色素含量和比例。紅光促進(jìn)葛仙米可溶性糖的積累，而藍(lán)光有利于可溶性蛋白的合成。葛仙米含有豐富的各種光合色素，具有較為廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，可作為天然色素在食品、化妝品、染料等工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用，并可制成熒光試劑用于醫(yī)學(xué)臨床診斷和免疫學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域，還可制成食品和藥品用于醫(yī)療保健[17]。葛仙米含有18種氨基酸，含有人體必需的8種氨基酸，其多糖具有較好的保健作用[17]。在葛仙米的人工養(yǎng)殖過程中應(yīng)該根據(jù)實(shí)際需要選擇不同顏色的光照。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳德文，汪興平，潘思軼. 葛仙米的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J]. 食品科學(xué)，2003，24(11)：153-156.

[2]田志環(huán)，焦傳珍. 葛仙米研究現(xiàn)狀及其開發(fā)前景[J]. 食品研究與開發(fā)，2007，28(2)：170-172.

[3]鄧中洋，閻春蘭，胡強(qiáng)，等. 葛仙米研究進(jìn)展[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2008，32(3)：393-399.

[4]陳珍. 農(nóng)藥和含氯化肥對(duì)食用藍(lán)藻葛仙米生長和光合作用的影響[D]. 武漢：華中師范大學(xué)，2007.

[5]Aidar E，Gianesella-Galvo S，Sigaud T，et al. Effects of light quality on growth，biochemical composition and photo synthetic production inCyclotellacaspiaGrunow andTetrasehisgracelis(Kylin)Butcher[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1994，180(2)：

175-187.

[6]Wang C Y，F(xiàn)u C C，Liu Y C. Effects of using light-emitting diodes on the cultivation ofSpirulinaplatensis[J]. Biochemical Engineering Journal，2007，37(1)：21-25.

[7]Das P，Wang L，Aziz S S，et al. Enhanced algae growth in both phototrophic and mixotrophic culture under blue light[J]. Bioresource Technology，2011，102(4)：3883-3887.

[8]毛安君. LED光源促進(jìn)微藻生長的研究[D]. 青島：中國海洋大學(xué)，2007.

[9]Whitton B A，Potts M. The ecology of cyanobacteria：their diversity in time and space[M]. Springer，Dordrecht，2000.

[10]蔡慶生. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2013：54-55.

[11]Hellebust J A，Craigie J S. Handbook of phycological methods：physiological and biochemical methods[M]. London：Cambridge University Press，1978：71-79.

[12]Korbee N，F(xiàn)igueroa F L，Aguilera J. Effect of light quality on the accumulation of photosynthetic pigments，proteins and mycosporine-like amino acids in the red algaPorphyraleucosticta(Bangiales，Rhodophyta)[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2005，80(2)：71-78.

[13]Kehoe D M，Grossman A R. Similarity of a chromatic adaptation sensor to phytochrome and ethylene receptors[J]. Science，1996，273(5280)：1409-1412.

[14]Demarsac N T. Occurrence and Nature of chromatic adaptation in cyanobacteria[J]. Journal of Bacteriology，1977，130(1)：82-91.

[15]王小琴. 鐵限制及petE基因失活對(duì)藍(lán)藻光合生理的影響[D]. 武漢：華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2015.

[16]王偉. 光質(zhì)對(duì)中華盒形藻生長及生化組成的影響[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)，1999，17(3)：197-200.

[17]田志環(huán). 稀有微藻葛仙米資源的研究與開發(fā)[J]. 資源開發(fā)與市場，2007，23(5)：450-451.