余思策， 李俊凱， 劉顯良， 杜曉英

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025)

蔬菜細(xì)菌性病害嚴(yán)重危害了蔬菜的品質(zhì)和產(chǎn)量，控制蔬菜病原細(xì)菌的藥劑主要是農(nóng)用抗生素[1]。但由于長期大量不科學(xué)地使用抗生素，產(chǎn)生的抗性問題越來越突出。因此，開發(fā)新型安全的殺菌劑顯得十分必要。植物產(chǎn)生的一些次生代謝產(chǎn)物很多具有抑菌活性[2-4]，目前，這方面的研究較多，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有抑菌活性的化合物[5-7]，但對本研究中采集到的6種古老珍稀植物的抑菌活性成分的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)汪超等研究了連香樹精油對玉米大斑病病菌、黑曲霉及根霉的抑菌活性[8]；Tada等從連香樹葉子的甲醇提取物中分離出2種對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有抑制作用的化合物[9]；金則新等研究了七子花不同時期、不同溶劑提取物對枯草芽孢桿菌等細(xì)菌的抑菌活性[10-11]。本試驗研究6種古老珍稀植物對3種蔬菜病原細(xì)菌的抑菌活性，以期為進(jìn)一步探尋這些植物的抑菌活性成分及新型殺菌劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試植物樣品供試植物樣品詳情如表1所示，均采自武漢植物園。

表1　供試植物詳細(xì)信息

1.1.2供試菌種及來源黃瓜細(xì)菌性角斑病病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)、魔芋軟腐病病菌(Erviniacarotovorapv.carotovora)、生姜青枯病病菌(Ralstoniasolanacearum)，均采自田間，經(jīng)室內(nèi)分離純化所得，由長江大學(xué)周燚教授鑒定。

1.1.3培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方：15 g/L瓊脂、10 g/L蔗糖、10 g/L 蛋白胨、3 g/L牛肉膏，pH值調(diào)至7.0。

1.2　試驗方法

1.2.1植物樣品的制備將采集的植物材料粉碎后用甲醇浸提3次，過濾后在50 ℃條件下減壓濃縮成膏狀，密封保存[12]。

1.2.26種植物甲醇提取物抑菌活性的測定將0.5 g膏狀提取物用2.5 mL丙酮溶解，取1 mL丙酮溶解液用含1‰吐溫80的無菌水定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的藥液。將供試病原細(xì)菌活化，配成濃度為105～106CFU/mL 的懸浮液。利用瓊脂打孔藥劑擴(kuò)散法[13]來測定各甲醇提取物的抑菌活性。每個培養(yǎng)皿倒入30 mL含有 200 μL 細(xì)菌懸浮液的50 ℃左右的培養(yǎng)基，冷卻后用滅菌打孔器打孔，并用少許瓊脂封底，加入50 μL配制好的無菌藥液，并設(shè)置溶劑對照組。在30 ℃條件下培養(yǎng)1 d，測量抑菌圈的直徑。每個處理重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.3連香樹甲醇提取物的最低抑菌濃度測定用丙酮將連香樹甲醇提取物配制成5.00、4.00、3.20、2.56、2.05、1.64、1.31、1.05、0.84、0.67 mg/mL等一系列濃度梯度的藥液，最低抑菌濃度測定方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.4連香樹甲醇提取物萃取物抑菌活性測定采取液-液分配萃取法，將連香樹甲醇提取物進(jìn)行初步分離。用少量甲醇溶解適量提取物，放在50 ℃恒溫水浴鍋熱溶后加10倍蒸餾水，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取。將各萃取液和水層減壓濃縮至膏狀，并在質(zhì)量濃度為5 mg/mL條件下對3種病原細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性測定，測定方法同“1.2.2”節(jié)。

2　結(jié)果與分析

2.1　6種古老珍稀植物甲醇提取物對3種蔬菜病原細(xì)菌的抑菌活性初篩

由表2可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時，連香樹甲醇提取物對3種蔬菜病原細(xì)菌的抑制活性最好，其抑菌圈直徑分別為1.31、1.68、1.10 cm；山白樹和牛鼻栓的甲醇提取物對魔芋軟腐病病菌、生姜青枯病病菌均有抑制活性，山白樹甲醇提取物對兩者的抑菌圈直徑分別為1.14、0.89 cm，牛鼻栓甲醇提取物對兩者的抑菌圈直徑分別為0.54、0.48 cm；其余植物對供試病原細(xì)菌均無抑制活性。

表2　6種古老珍稀植物甲醇提取物對3種病原細(xì)菌的抑制效果

注：“-”表示沒有活性，下表同；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，表4同。

2.2　連香樹甲醇提取物對3種蔬菜病原細(xì)菌的最低抑菌濃度測定

為明確連香樹甲醇提取物對供試病原細(xì)菌的最低抑制濃度，采取瓊脂打孔藥劑擴(kuò)散法對其進(jìn)行測定。由表3可知，連香樹對3種病原細(xì)菌的最低抑制濃度均為1.64 mg/mL。

2.3　連香樹甲醇提取物各萃取相對3種蔬菜病原細(xì)菌的抑制活性測定

由表4可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，連香樹甲醇提取物除石油醚相外，其他各萃取相對3種病原細(xì)菌均有抑制效果，其中，乙酸乙酯相、水相表現(xiàn)出較好的抑制效果，抑菌圈直徑分別大于2.3、1.8 cm，石油醚相對這3種病原細(xì)菌均沒有抑制活性。可以初步判斷出連香樹甲醇提取物中具有抑菌活性成分化合物的極性較大。

3　結(jié)論與討論

質(zhì)量濃度為20 mg/mL時，本研究的植物材料中只有連香樹、山白樹、牛鼻栓等3種植物的甲醇提取物對3種供試病原細(xì)菌有抑制活性，其中，連香樹甲醇提取物的抑制活性最好，其最低抑菌濃度為1.64 mg/mL。采用液-液分配萃取法分離并對連香樹提取物進(jìn)行生物測定。研究表明，連香樹甲醇提取物抑菌活性成分的極性較大，此結(jié)果與Tada等從連香樹葉甲醇提取物乙酸乙酯萃取層分離到的2種抑菌化合物[9]相一致，可以進(jìn)一步對其做色譜分離。山白樹的抑菌活性也較好，可以對其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

表4　5 mg/mL連香樹甲醇提取物各萃取相對

珍稀瀕危植物往往因為其生活的特殊環(huán)境為人類提供了珍稀的物質(zhì)材料。本試驗采集到的6種古老珍稀植物中，有3種植物的甲醇提取物具有抑菌活性，因此，古老珍稀植物可能是一個開發(fā)植物源殺菌劑的方向。

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