杭柏林， 徐　軍， 胡建和

(河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003)

抗菌肽(antimicrobial peptides，簡稱AMPs)是生物機體內具有抗細菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學活性的多肽，是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]?？咕木哂械投尽⒏咝?、抗菌譜廣、低耐藥等特點，成為抗生素替代物研究中的佼佼者[3-4]。Krause等從人血液中分離到肝臟表達的抗菌肽LEAP-1、2，其中Ⅱ型肝臟表達抗菌肽(liver-expressed antimicrobial peptide 2，簡稱LEAP-2)有較強的抗微生物活性，但肽的序列、二級結構和表達等方面與其他已知肽類有差異[5]。從雞體內分離到的LEAP-2由76個氨基酸構成，具有抗微生物(如沙門氏菌)的活性[6]。但雞LEAP-2(cLEAP-2)的許多生物信息學內容還不是很清楚。因此，本研究基于cLEAP-2的氨基酸序列利用在線生物軟件和程序進行生物信息學分析，為深入探討其抗菌作用機制提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

雞內源性抗菌肽LEAP-2的氨基酸來自網站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/，登錄號為NP_001001606，其序列為MHCLKIMAFLLFFSLLLSQVYCASLHQPQPLLRLKRMT PFWRGVSLRPVGASCRDNSECITMLCRKNRCFLRTASE。

1.2　方法

1.2.1抗菌肽理化性質分析利用www.expasy.org/tools網站中的ProtParam工具對抗菌肽cLEAP-2進行理化性質參數(shù)的分析。

1.2.2抗菌肽的二級結構預測利用https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html網站的二級結構預測工具進行抗菌肽cLEAP-2的二級結構預測。

1.2.3抗菌肽的跨膜區(qū)分析利用http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html網站的TMpred網站的工具進行抗菌肽cLEAP-2的跨膜區(qū)分析。

1.2.4抗菌肽的信號肽預測利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網站的Signal4.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的信號肽。

1.2.5抗菌肽細胞內定位的預測利用http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/eu_predict.htm網站的亞細胞定位分析工具Sublocal v1.0進行抗菌肽cLEAP-2的細胞內定位預測。

1.2.6抗菌肽糖基化和磷酸化位點預測利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/網站的NetOGlyc 4.0 Server工具和http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網站的NetPhos3.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位點。

1.2.7抗菌肽的三維空間結構分析利用http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1網站的工具進行抗菌肽cLEAP-2三級結構的預測。

1.2.8抗菌肽保守結構域的預測利用http：//smart.embl-heidelberg.de/網站中的工具進行抗菌肽cLEAP-2保守結構域的預測。

1.2.9抗菌肽的抗原表位分析利用DNAStar軟件中的Protean工具進行抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析。

1.2.10抗菌肽的氨基酸序列進化分析在GenBank中檢索到雞和其他42個物種的LEAP-2的氨基酸序列。利用DNAstar軟件中的MegAlign工具，采用Jotun Hein算法進行抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列進化分析。

2　結果與分析

2.1　抗菌肽cLEAP-2的理化性質

雞內源性抗菌肽cLEAP-2分子式為C392H635N113O99S10，有76個氨基酸殘基，由20種基本氨基酸組成，所含的氨基酸殘基數(shù)量和含量見表1。cLEAP-2的分子量為 8 835.65 u，等電點為9.86，帶負電的殘基(Asp+Glu)數(shù)為3個，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)數(shù)為11個。在體外，cLEAP-2 的半衰期在哺乳動物細胞中為30 h，在酵母中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。經軟件計算，不穩(wěn)定指數(shù)為57.27，表明cLEAP-2為不穩(wěn)定蛋白?？侴RAVY值為0.205，表明cLEAP-2為疏水蛋白。

表1　cLEAP-2的氨基酸組成

2.2　抗菌肽cLEAP-2的二級結構

經軟件分析(參數(shù)：window width為17，similarity threshold為8，number of states為4)，cLEAP-2的二級結構(圖1)中，α螺旋(36個氨基酸殘基參與)占47.31%，延伸鏈(9個氨基酸殘基參與)占11.84%，β轉角(6個氨基酸殘基參與)占7.89%，無規(guī)則卷曲(25個氨基酸殘基參與)占32.89%。

2.3　抗菌肽cLEAP-2的跨膜區(qū)預測

經軟件分析(參數(shù)：跨膜螺旋長度為17～33aa，得分>500)，cLEAP-2存在跨膜區(qū)(圖2)。從里(inside，簡稱i)到外(outside，簡稱o)，可能存在于第6～23位氨基酸殘基之間(得分為2 090)；從外到里，可能存在于第3～21位氨基酸殘基之間(得分為1 748)。

2.4　抗菌肽cLEAP-2的信號肽預測

經軟件分析(Cutoff為0.45)，cLEAP-2存在信號肽(圖3)，位于第1～22位氨基酸殘基之間，得分為0.937。信號肽與成熟肽的剪切位點在第22位和第23位氨基酸殘基之間。

2.5　抗菌肽cLEAP-2的細胞內定位

經軟件分析，cLEAP-2主要定位于細胞核內[可信度指數(shù)(reliability index)=4，預期準確率(expected accurcy=91%)]。

2.6　抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位點

經軟件分析，cLEAP-2存在糖基化位點(得分>0.5)，分別是第45、52位的絲氨酸殘基(得分分別為0.746、0.705)。對絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化進行分析，結果見表2，有5個絲氨酸殘基和3個蘇氨酸殘基存在8個磷酸化位點(得分均>0.5)，但沒有酪氨酸的磷酸化位點。推測不同的位點可被不同的激酶引發(fā)磷酸化。

表2　cLEAP-2的磷酸化位點預測

注：PKC為蛋白激酶C，PKA為蛋白激酶A，PKG為蛋白激酶G，cdc2為細胞分裂周期蛋白2，cdk5為細胞周期素依賴蛋白激酶5，RSK為核糖體S6激酶，CKⅡ為酪蛋白激酶2，unsp為某種非特異性蛋白激酶(即不在系統(tǒng)中的某種激酶)。

2.7　抗菌肽cLEAP-2的三級結構預測

經軟件分析，cLEAP-2的三級結構見圖4。cLEAP-2的第37～76位氨基酸與SWISS-MODEL TEMPLATE LIBRARY中模板[2L1qA](99.9 ?) HUMAN LIVER EXPRESSED ANTIMICROBIAL的序列相似度為80%，E值為9.02×10-11，預測結果的QMEAN Z值為-1.13。cLEAP-2由α螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲構成，與預測的二級結構結果一致。

2.8　抗菌肽cLEAP-2的功能結構域預測

經軟件分析，cLEAP-2與Pfam數(shù)據庫中LEAP-2的結構相似(E值為7.8×10-44)。cLEAP-2的第37～76位氨基酸與PDB：2L1q│A相似(E值為1.0×10-17)，第1～22位氨基酸殘基為信號肽功能結構域，這與前面的預測結果相一致。Low complexity region位于第9～18位氨基酸殘基(圖5)。

2.9　抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析

經軟件分析，由圖6可知cLEAP-2的親水性、表面可及性、柔韌性和抗原性等指數(shù)。親水性指數(shù)>0、抗原性指數(shù)>0、可及性指數(shù)>1時，可能存在抗原表位。據此綜合分析，認為cLEAP-2可能存在多個抗原表位。

2.10　抗菌肽cLEAP-2的氨基酸系統(tǒng)進化

將雞內源性抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列與其他42個物種的LEAP-2的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，獲得系統(tǒng)樹。由圖7可知，雞(Gallusgallus)內源性抗菌肽cLEAP-2與日本鵪鶉(Coturnixjaponica)LEAP-2的進化關系最近，而與漠林鼠(Neotomalepida)LEAP-2的進化關系最遠。

3　討論

雞內源性抗菌肽LEAP-2是陽離子性抗菌肽[6]。本研究通過在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)cLEAP-2帶11個正電荷的氨基酸殘基和2個負電荷的氨基酸殘基，分析其總體帶正電荷，認為cLEAP-2是陽離子型抗菌肽。

一般認為，抗菌肽的分子量小，沒有免疫原性[7]，且免疫學中認為分子量在10 000以上的物質有較好的抗原性[8-9]。cLEAP-2由76個氨基酸殘基構成，分子量為8 835.65 u。然而，分子量雖小，但分子結構復雜的物質也具有抗原性[8]。抗原表位可由5～17個氨基酸殘基構成[10]。經DNAStar軟件分析，cLEAP-2可能存在幾個抗原表位。因此，cLEAP-2存在抗原表位可能與其存在三維空間結構有關。但這還需要進一步深入探討。

分析后發(fā)現(xiàn)cLEAP-2存在信號肽。這與高榮琨等的研究結果[11]相一致。信號肽可使新合成的多肽分泌到細胞外，從而發(fā)揮生理功能[12]。由此推測，cLEAP-2表達后，可到達細胞外發(fā)揮抗病原微生物等正常生理活性。同時，分析后發(fā)現(xiàn)，cLEAP-2定位于細胞核內，對該定位的生物學作用還有待深入研究。

螺旋結構是抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的重要結構基礎[13]。經分析，cLEAP-2的二級結構中存在多個α螺旋區(qū)及其他結構?？梢酝茰y，這些α螺旋可能是cLEAP-2發(fā)揮抗菌作用的結構基礎。這一點得到功能結構域預測的佐證。

蛋白的磷酸化和糖基化可以改變蛋白的構象和增加蛋白的穩(wěn)定性，從而調節(jié)蛋白的許多生物學功能[14-15]。經預測發(fā)現(xiàn)，cLEAP-2有2個糖基化位點和8個磷酸化位點。同時預測發(fā)現(xiàn)cLEAP-2是不穩(wěn)定的疏水蛋白。因此，糖基化和磷酸化可能使cLEAP-2變得穩(wěn)定，從而使得cLEAP-2能很好地發(fā)揮其功能。

從表11中可以看出：基于K-means算法的評選方法得到的結果都是2015級的班級，這是因為其年級較高，評價班級的相關屬性基本都有取值，而傳統(tǒng)評選方法得到的結果也基本都是較高年級的班級，同時，其存在部分屬性取值較高的、發(fā)展失衡的情況。因此，采用基于K-means算法的優(yōu)秀班集體評選方法，選取不同年級內均衡發(fā)展的優(yōu)秀班集體，比傳統(tǒng)評選方法更合理。

分子進化依賴于核酸和蛋白質的序列信息，是闡明物種間相互關系的分子基礎[16]。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，雞源抗菌肽LEAP-2與日本鵪鶉的LEAP-2之間的關系最近，表明抗菌肽LEAP-2在雞和日本鵪鶉中相對保守。

耐藥性或多重耐藥性細菌與真菌的出現(xiàn)使得現(xiàn)有抗菌藥物的療效低下或無效，對人類和動物健康的威脅日趨嚴重[7，17]，尋找新的抗菌物質具有重要意義[18-19]，抗菌肽被認為是理想的抗生素替代物[17]。雞體內的抗菌肽類型主要有β-防御素、cathelicidin和LEAP-2[1]，這幾種抗菌肽在結構和功能上均有差異。目前，對雞抗菌肽LEAP-2的研究還很少。因此，通過生物軟件分析雞抗菌肽LEAP-2的生物信息學內容為深入研究其功能與應用奠定基礎。

4　結論

本研究結果揭示，雞內源性抗菌肽LEAP-2為不穩(wěn)定的、帶正電荷的疏水性蛋白，有1個跨膜區(qū)和1個信號肽，有2個糖基化位點和8個磷酸化位點，二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，三級結構和功能結構域與人LEAP-2有很高的相似度，存在抗原表位，與日本鵪鶉有非常近的進化關系。

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