朱建蕊 翟偉鋒

摘 要 為獲得穩(wěn)定表達(dá)及較好免疫效力的重組NNV衣殼蛋白，對已公布的石斑魚神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并構(gòu)建表達(dá)載體pET32a-NNV，于大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)、表達(dá)，將包涵體純化后碾磨成粉添加到黃粉蟲飼料中，用蟲體粉末喂食石斑魚，攻毒保護(hù)試驗檢測免疫效力。結(jié)果獲得高表達(dá)的NNV衣殼蛋白包涵體，目的蛋白占總蛋白的比率達(dá)70%，純化后純度達(dá)95%；且喂食本技術(shù)制備的黃粉蟲粉末后石斑魚對NNV抵抗力顯著提高，存活率由5%上升至83%。本研究提供一種重組NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)和純化方法，為石斑魚神經(jīng)壞死病毒疫苗的商品化推廣奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 石斑魚；神經(jīng)壞死病毒；衣殼蛋白；疫苗

中圖分類號：S943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.06.063

石斑魚是一種重要的經(jīng)濟魚類。神經(jīng)壞死病毒（NNV）可攻擊石斑魚的神經(jīng)系統(tǒng)，造成致命性的病毒腦病和視網(wǎng)膜病變[1]，是魚苗培育過程中重大病害之一。一旦爆發(fā)，會造成仔、稚魚的大量死亡，成為制約石斑魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前，應(yīng)對方法主要是阻斷傳播途徑、篩選未攜帶病毒的親魚以切斷垂直傳播、利用碘試劑等消毒方法以減少水平傳播，但前者受檢測靈敏度限制，后者無法確保消毒徹底，因此疫苗是防治石斑魚神經(jīng)壞死病的重要方法之一。至今已基于大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞和酵母系統(tǒng)成功表達(dá)NNV主衣殼蛋白，電鏡下可見病毒樣顆粒形成，動物實驗顯示其具有良好的免疫原性[2]。然而傳統(tǒng)注射重組病毒樣顆粒的免疫方法，雖然對較長魚苗具有較好的免疫保護(hù)作用，但對特異性免疫還未成熟的石斑魚稚苗來說，則很難達(dá)到防治的目的，因而通過開發(fā)口服類疫苗被動免疫稚魚，將是針對稚魚免疫系統(tǒng)特點的較為有效的一種預(yù)防措施[3]。

因此本研究以制備穩(wěn)定表達(dá)以及較好免疫效力的NNV衣殼蛋白為出發(fā)點，利用基因工程技術(shù)獲得高表達(dá)的NNV衣殼蛋白包涵體，并建立了一種操作簡單、可行性強的喂食免疫方法，為石斑魚神經(jīng)壞死病毒疫苗的商品化推廣提供了可能性，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

pET32a原核表達(dá)載體，大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本實驗室保存。健康斜帶石斑魚（Epinephelus coioids）以及黃粉蟲（Tenebrio molitor）均由福建水產(chǎn)研究所提供。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、連接試劑盒、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、預(yù)染蛋白marker，均購自賽默飛；IPTG，購自麥克林。

裂解液：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl、125 mmol·L-1 咪唑。緩沖液B1：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl、1% TritonX-100。緩沖液B2：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl。均由本實驗室配制和保存。

1.1.3 儀器

超凈工作臺，購自AIRTECH；恒溫?fù)u床購，自上海智城分析儀器制造公司；均質(zhì)機，購自AVESTIN；超速離心機，購自Thermo Scientific；電泳儀，購自Bio-Rad；凝膠成像儀，購自上海復(fù)日科技有限公司；冷凍干燥機，購自上海皓莊儀器有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基（抗生素濃度為50 μg·mL-1）；氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基：

LB液體培養(yǎng)基+1.2%瓊脂粉（抗生素濃度為50 μg·mL-1）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計

檢索NCBI數(shù)據(jù)庫得NNV衣殼蛋白基因序列（accession： KC696562.1），并對其進(jìn)行優(yōu)化，第15～18個氨基酸由TKAA變?yōu)镽G。引物序列設(shè)計如下，上游引物：5-CATGCCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3（劃線部分為NcoⅠ酶切位點）；下游引物：5-CCGCTCGAGTTAAGTGCAGACAGTGCC-3（劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。基因和引物序列均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增目的基因

擴增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，設(shè)定每個循環(huán)為95℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用Omega膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.3 載體構(gòu)建

將pET-32a載體與回收的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物于25 ℃連接2 h；連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基。隨機挑取單克隆，使用Omega質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，對所提質(zhì)粒作雙酶切驗證，取陽性結(jié)果提交蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.4 NNV衣殼蛋白的小量表達(dá)

將pET-32a-NNV轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單菌落于6 mL氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r·min-1條件下培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)0.6時，取500 μL作為種子液，37℃、220 r·min條件下過夜培養(yǎng)；剩余菌液降溫至25℃，加入IPTG使其終濃度為1 mmol·L-1，于200 r·min-1恒溫?fù)u床中誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)完成后取菌液離心，使用裂解液重懸菌體，超聲破碎，離心取上清和沉淀利用SDS-PAGE分析NNV衣殼蛋白的表達(dá)情況。同時取種子液菌體做空白對照。

1.2.5 NNV衣殼蛋白發(fā)酵表達(dá)

種子液按1∶100比例接入500 mL氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r·min-1條件下恒溫培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)0.6時降溫至25 ℃，加入IPTG使其終濃度為1 mmol·L-1，于200 r·min-1恒溫?fù)u床中誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。

1.2.6 NNV衣殼蛋白包涵體純化

菌體使用裂解液重懸，高壓均質(zhì)機破碎，離心收集沉淀，1）加入緩沖液B1混勻，25 ℃振蕩；2）離心棄上清，加入緩沖液B2混勻，25 ℃振蕩；3）離心棄上清，加入純水混勻，25 ℃振蕩；4）重復(fù)步驟上一步驟兩次；5）離心棄上清，取少量沉淀用裂解液重懸，SDS-PAGE分析，剩余沉淀冷凍干燥后碾磨，過80目篩，得NNV衣殼蛋白粉末。

1.2.7 蟲體粉末制備

取3齡期黃粉蟲，將NNV衣殼蛋白粉末按蟲體平均體重的1%添加到黃粉蟲飼料中喂食，培養(yǎng)至4齡期時，將蟲體冷凍干燥，碾磨成粉末，過80目篩。

1.2.8 免疫效力檢測

在2 000 L的放養(yǎng)池中放養(yǎng)健康斜帶石斑魚300尾，將蟲體粉末按魚體重1.5%添加到魚飼料中喂食石斑魚，每周喂食1次，共喂食3次。將感染了神經(jīng)壞死病的石斑魚加水打碎成漿后離心，以上清為攻毒源投入魚池，16 d內(nèi)每天統(tǒng)計魚死亡數(shù)，以此計算存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增目的基因

以人工合成的NNV衣殼蛋白目的基因序列為模板進(jìn)行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后得約1 000 bp的條帶，與預(yù)計的片段長度大小一致，如圖1A所示。

2.2 pET-32a-NNV載體的構(gòu)建和鑒定

載體和片段分別使用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切（圖1B），回收后連接。挑單克隆過夜培養(yǎng)、提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗證，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后可見線性化的載體下方有1 000 bp左右的條帶（圖1C），測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-32a-NNV序列完全正確。

2.3 NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中的小量表達(dá)

誘導(dǎo)表達(dá)完成經(jīng)離心收集菌體，重懸后超聲破碎，分別取未誘導(dǎo)全菌、誘導(dǎo)后全菌、破碎后上清和破碎后沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖2A所示，對照未誘導(dǎo)全菌明顯可見約58 kDa處條帶，與預(yù)期融合表達(dá)標(biāo)簽的目的蛋白大小基本一致，證明NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中可高效表達(dá)，且以包涵體形式存在。

2.4 NNV衣殼蛋白發(fā)酵表達(dá)

由小量表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行擴大培養(yǎng)，取保存的種子復(fù)蘇后按1：100比例接入搖瓶中，培養(yǎng)以及誘導(dǎo)條件與小量表達(dá)相同；經(jīng)收集菌體、裂解液重懸、均質(zhì)機破碎后，取全菌、破碎后菌體上清以及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖2B中的1～3所示，可見目的蛋白約占總蛋白量的70%，且以包涵體形式存在于沉淀中。

2.5 NNV衣殼蛋白包涵體純化

對NNV衣殼蛋白包涵體進(jìn)行純化，按順序分別使用緩沖液B1、B2以及純水與各步所得沉淀混勻后于25 ℃振蕩30 min，最后離心取沉淀用裂解液重懸并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖2B中的4，可見純化后NNV衣殼蛋白包涵體純度達(dá)95%。剩余沉淀經(jīng)冷凍干燥、碾磨、過80目篩獲得NNV衣殼蛋白粉末。

2.6 蟲體粉末制備

正常喂食以及將NNV衣殼蛋白粉末作為飼料添加劑喂食的黃粉蟲分別代表對照組和實驗組。兩組除飼料成分有差別外，其他條件均相同。進(jìn)而分別將兩組蟲體冷凍干燥后碾磨成粉得對照組和實驗組蟲體粉末。

2.7 免疫效力檢測

喂食對照組和實驗組黃粉蟲粉末的石斑魚分別對應(yīng)對照組和免疫組石斑魚，兩組石斑魚除飼料成分有差別外，其他條件均相同。3次喂食后進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，攻毒源投入后，一些魚類出現(xiàn)神經(jīng)紊亂癥狀并伴有螺旋式游泳，對16 d內(nèi)石斑魚存活率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。隨時間的延長，兩組石斑魚存活數(shù)量均有下降，而16 d后實驗組石斑魚存活率達(dá)83%，對照組卻僅為5%。對16 d內(nèi)兩組石斑魚數(shù)量對比，表明喂食本技術(shù)制備的NNV衣殼蛋白粉末的石斑魚對NNV抵抗力較對照組明顯提高，能有效抵抗神經(jīng)壞死病癥。

3 討論

隨著石斑魚人工繁育技術(shù)的突破，我國石斑魚工業(yè)化養(yǎng)殖不斷發(fā)展，但長期存在的神經(jīng)壞死病毒對石斑魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅，應(yīng)對措施主要是阻斷病毒的垂直傳播和水平傳播，但均存在安全隱患；提高病毒檢測靈敏度是重要的研究方向之一，目前已建立PCR法、ELISA、細(xì)胞培養(yǎng)以及組織病理方法等檢測、診斷技術(shù)，但實際情況下受到檢測特異性、細(xì)胞培養(yǎng)以及制備病毒抗體等方面的限制[4]。另有報道使用天然免疫增強劑作為餌料添加或直接拋灑，但多為輔助手段，因此在石斑魚魚苗的培育過程中，疫苗是防治神經(jīng)壞死病癥的重要方法，相對傳統(tǒng)滅活苗，基因工程疫苗成本低、免疫原性好、安全性高的優(yōu)點顯著，是疫苗研發(fā)的重要方向，目前研究主要集中在亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗以及DNA疫苗的制備。

本研究利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中高效表達(dá)NNV衣殼蛋白，pET表達(dá)質(zhì)粒含有強啟動子，可相對較高效表達(dá)外源蛋白，因此本實驗根據(jù)前期實驗結(jié)果，采用pET32a載體，并對NNV衣殼蛋白氨基酸序列進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得以包涵體形式存在的高表達(dá)的目的蛋白，融合表達(dá)的蛋白分子量約為58 kDa，相對于可溶性表達(dá)的目的蛋白，其優(yōu)勢在于大大提高了表達(dá)量，同時具有高穩(wěn)定性的特點，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能[5]。

然而傳統(tǒng)注射免疫方法操作繁瑣，大規(guī)模使用受限，而口服類疫苗操作簡單、可行性強，并且可針對稚魚免疫系統(tǒng)特點，被動免疫稚魚，是目前較理想的一種預(yù)防措施。因此，本研究對NNV衣殼蛋白包涵體進(jìn)行純化、冷凍干燥得衣殼蛋白粉末，將喂食NNV衣殼蛋白粉末的黃粉蟲作為石斑魚飼料添加劑，操作簡單，可行性強，攻毒保護(hù)試驗得出本研究使用的免疫技術(shù)對石斑魚具有良好的免疫保護(hù)性效果，能有效抑制石斑魚神經(jīng)壞死病。且本技術(shù)所涉及的黃粉蟲養(yǎng)殖，操作簡單、周期短、成本低、節(jié)省空間；另黃粉蟲養(yǎng)殖不傳播疾病，無需防疫。此外與注射免疫的方法相比，喂食免疫方法可行性強，僅在常規(guī)飼料中多添加喂食NNV衣殼蛋白的黃粉蟲粉末一種原料即可實現(xiàn)明顯免疫效果，極大地提高了工作效率。

4 結(jié)論

本研究成功實現(xiàn)了石斑魚神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白的高效穩(wěn)定表達(dá)，同時基于NNV衣殼蛋白包涵體，采用喂食免疫法實現(xiàn)對石斑魚的免疫防治，為實行石斑魚神經(jīng)壞死病毒疫苗的商品化奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：劉昀）