王 歡，郝舒捷，唐小曉

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

膿毒癥(Sepsis)是由于感染等原因?qū)е碌娜硇匝装Y反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)[1]，同時(shí)也是人類發(fā)生感染后的一種常見癥狀，而且極其容易引起臨床患者的死亡[2]。膿毒性腦病是重癥監(jiān)護(hù)ICU（Intensive Care Unit）常見的腦病之一，由于缺少中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的數(shù)據(jù)證明，一部分專家認(rèn)為，由全身炎癥反應(yīng)引起的彌散性腦功能障礙是膿毒性腦病，另一部分專家認(rèn)為膿毒性腦病為膿毒癥相關(guān)性腦病、中毒性腦病[3]。據(jù)調(diào)查報(bào)告顯示，膿毒癥的發(fā)生每年還在以2%～8%的速率增加，雖然抗感染治療和臟器支持技術(shù)不斷進(jìn)步，但是死亡率仍然高達(dá)35%～65%[4]。膿毒性腦病的可能機(jī)制有線粒體及內(nèi)皮功能障礙、直接腦細(xì)胞損傷、腦組織中鈣穩(wěn)態(tài)變化和神經(jīng)傳遞失調(diào)等。臨床通常使用鎮(zhèn)靜、肌松等藥物，同時(shí)結(jié)合使用呼吸機(jī)進(jìn)行治療，這種治療手段與病人患有影響腦病判斷的其他疾病等多種因素有關(guān)，在膿毒癥的后期階段，各種器官功能的衰竭可以引發(fā)膿毒性腦病。與此同時(shí)，某些醫(yī)源性因素也可以引發(fā)腦病。在歐美國家和中東地區(qū)，年均大概40萬患者死于膿毒癥及其并發(fā)癥，且其治療費(fèi)用高達(dá)約1600億人民幣，這給每個(gè)家庭乃至全社會(huì)帶來相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)壓力。

膿毒性腦病的病理生理過程極為復(fù)雜，至今還有很多機(jī)制沒有闡述清楚，膿毒癥的反復(fù)發(fā)病顯示它一直都并未被完全控制。目前針對(duì)腦病主要是對(duì)癥治療，主要目標(biāo)是恢復(fù)腦功能、控制感染。降低感染率的前提是充分認(rèn)識(shí)引起感染的解剖結(jié)構(gòu)，恢復(fù)正常功能，選取有效的藥物。膿毒性腦病患者大部分都會(huì)出現(xiàn)血腦屏障功能障礙，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，致使細(xì)胞腫脹，加重腦水腫，于是在維持正常需要的狀況下，臨床應(yīng)該嚴(yán)格要求每天輸液的多少，同時(shí)維持電解質(zhì)濃度，因?yàn)檩^低的血鈣和血鎂將會(huì)加重腦水腫。在20世紀(jì)70年代就有專家提出，給病人注射20%支鏈氨基酸是可以改善血漿中氨基酸比例失衡，從而減少膿毒性腦病的各種癥狀[5]。增多血中側(cè)鏈氨基酸是可以利于介質(zhì)的促成，同時(shí)增進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)功能。所以，使用支鏈氨基酸來治療膿毒性腦病或許是有效果的[6]。除此之外，一些實(shí)驗(yàn)顯示，把膿毒性腦病發(fā)病的機(jī)制作為參考依據(jù)來治療的辦法包括針對(duì)炎癥反應(yīng)、血-腦脊液屏障和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙、腦內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)的激活[7,8]。由于膿毒癥動(dòng)物模型的應(yīng)用對(duì)推動(dòng)膿毒癥治療措施的研究起到了非常重要的作用，隨著學(xué)者對(duì)膿毒癥的根本原因的更深入了解與研究，膿毒癥動(dòng)物模型正在持續(xù)進(jìn)展中。

研究者們對(duì)膿毒癥已經(jīng)做了大量的研究，它的病理生理學(xué)的研究進(jìn)展依賴于各種動(dòng)物模型?，F(xiàn)今，不同種屬和各種誘導(dǎo)方法的膿毒癥動(dòng)物模型已經(jīng)存在[7]，其中小鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）模型因成本較低，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用最多，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)可能引起小鼠腹腔內(nèi)各種細(xì)菌的感染，繼而急性腹膜炎被誘發(fā)，然后導(dǎo)致細(xì)菌流入血液，引起全身炎癥反應(yīng)的綜合癥[8]。因?yàn)檫@個(gè)模型可以更加形象的模仿臨床膿毒癥和多種心臟器官的功能衰竭綜合征相關(guān)的病理過程，所以被認(rèn)為是制備膿毒癥動(dòng)物模型的黃金標(biāo)準(zhǔn)。可是，缺乏評(píng)價(jià)指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范是當(dāng)今CLP模型的一大問題。于是本研究將分析和研究討論目前存在的動(dòng)物模型，例如CLP建立小鼠膿毒癥模型，從而建立更能形象有效模擬臨床實(shí)際情況的膿毒癥動(dòng)物模型，設(shè)計(jì)一個(gè)合理的實(shí)驗(yàn)方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性C57BL/6J野生(WT)小鼠，小鼠清潔健康，體重在22～30 g，8～9周齡，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均以中國科學(xué)技術(shù)部頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(1988，No.134)為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

（1）實(shí)驗(yàn)試劑：

十二烷基硫酸鈉（SDS）生理鹽水（上海邦景實(shí)業(yè)有限公司）、水合氯醛（上海朗生生物科技有限公司）、葡萄糖（上海弘順生物科技有限公司）、碳酸氫鈉（化學(xué)試劑三廠）、慶大霉素（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）、青霉素（上海江萊生物科技有限公司）

（2）儀器：SZ-93自動(dòng)雙純水蒸餾器（廣東瑞沃德）、單臂腦立體定位儀（68001）（新芝生物公司）、XW-80A漩渦混合器（醫(yī)科大學(xué)器械廠）、超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)）、超低溫冰箱（德國Zeiss公司）、微量移液器（亞榮生化儀器廠）、制冰機(jī)DYY-12型電泳儀（日本Sanyo公司）、YX0602型蒸汽消毒器（德國Eppendorf公司）、5417R冷凍高速離心機(jī)（亞榮生化儀器廠）。

手術(shù)器械：手術(shù)刀，組織剪，手術(shù)固定板，粗剪刀，眼科鑷子，眼科剪，組織鑷子，持針器，另外準(zhǔn)備1 mL及 5 mL注射器，生理鹽水，頭皮針，棉簽及腦模具等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 常用液體配制

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的常用液體：（配液所需的H2O為三蒸水）1×PBS液：8.00 g氯化鈉+0.20 g氯化鉀 +1.44 g，Na2HPO4+0.24 g，KH2PO4加 H2O定 量 至1000 mL；0.2 mol/L的PB原 液：5.92 g NaH2PO4˙2H2O + 58.00 g Na2HPO4˙12H2O， 加H2O定量至1000 mL；10 mmol/L的PBS溶液：50 mL 0.2 mol/L PB+9.00 g 氯化鈉，加H2O定量至1000 mL；3%水合氯醛：稱取0.6 g水合氯醛，用0.9% NaCl注射液溶解定量至20 mL； 人工腦脊液（ACSF）：100mlACSF母液（10×）+1.98 g葡萄糖+2.1 g碳酸氫鈉，加水定量至1000mL。

1.3.2 建立小鼠膿毒癥模型(CLP動(dòng)物模型的制備)術(shù)前準(zhǔn)備

取成年雄性C57BL/6J野生(WT)小鼠15只，分成A組（輕型CLP造模組），B組（重型CLP造模組）和C組（Sham假手術(shù)組），每組各5只，同時(shí)禁食12 h，但讓它們正常飲水。

1.3.3 小鼠膿毒癥模型(CLP動(dòng)物模型的制備)手術(shù)過程

對(duì)于A組和B組小鼠，首先在腹腔注射3%水合氯醛400 mg/kg進(jìn)行麻醉，使小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)。接下來小鼠取仰臥位，刮掉小鼠腹部的毛，腹部皮膚用75%酒精消毒[7]，用手術(shù)刀在腹白線中點(diǎn)下方約0.3 cm處逐層剪開表皮、肌層和腹膜(切口長度約1～2 cm)，尋找到盲腸，然后將其分離，注意別傷害腸系膜血管。在盲腸長度1/2或3/4的位置用4號(hào)無蒂絲線進(jìn)行環(huán)形結(jié)扎。然后在盲端末以上約0.5 cm處端，A組使用21號(hào)針頭(半徑0.8 mm)，B組使用18號(hào)針頭(半徑1.2 mm)進(jìn)行貫通穿孔，從腸內(nèi)擠出一定量的容物，把盲腸小心放回原處，一定要小心別讓腸內(nèi)容物（糞便等）粘附在手術(shù)切口。最后還要利用4號(hào)無菌絲線每一層進(jìn)行縫合關(guān)腹。在縫合腹部之前在手術(shù)的局部使用一些慶大霉素，在縫合時(shí)候消毒要進(jìn)行縫合的頸部皮膚。對(duì)于C組（Sham假手術(shù)組）小鼠，僅僅進(jìn)行開腹游離盲腸，可是并不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔，最后用同樣方法進(jìn)行腹部縫合。

1.3.4 小鼠膿毒癥模型(CLP動(dòng)物模型的制備)手術(shù)后處理

給每一只小鼠在皮下注射1 mL濃度為20 mL/kg、溫度為37 ℃的生理鹽水來補(bǔ)充液體，在肌肉注射青霉素80萬U/kg。注意事項(xiàng)：在手術(shù)過程中和手術(shù)完成之后直到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物恢復(fù)，可以進(jìn)行活動(dòng)前，必須維持動(dòng)物的肛溫在37±1℃。然后便可以觀察各組小鼠狀態(tài)，確認(rèn)眼周是否有白色膿性分泌物，精神狀態(tài)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)（體重，肛溫及行為學(xué)改變）。

1.3.5 小鼠稱重

觀察各組小鼠的生理狀況并且每天稱量一次小鼠的體重，分別記錄每組每只小鼠的重量。

1.3.6 心包穿刺術(shù)

心包穿刺術(shù)是將穿刺針和留置導(dǎo)管置入心包腔，然后抽取心包積液。用這個(gè)方法取血，備用于內(nèi)毒素的檢測(cè)。

1.3.7 內(nèi)毒素檢測(cè)

分別于實(shí)驗(yàn)前后后抽取A、B、C三組小鼠的靜脈血進(jìn)行血漿內(nèi)毒素測(cè)定。然后制備血漿，在一次性無菌無熱原真空采血管中放入少許無菌抗凝劑，然后用其采取靜脈血。用離心機(jī)離心1 min，3000 rpm/min，將血漿分離出來，要求在取出后的十分鐘之內(nèi)使用。然后制備待測(cè)樣品，取血小板血漿樣本處理液中，將其混勻，放入70 ℃培養(yǎng)箱，10 min后放入冷卻槽冷卻。最后便是采用免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各項(xiàng)結(jié)果全部用Mean土S.E.M.表示，多組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可以采用方差進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)定，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 CLP術(shù)后小鼠一般觀察

CLP術(shù)后小鼠精力不旺盛，反應(yīng)遲鈍且行動(dòng)頻率明顯降低，后背的毛發(fā)立起，肛門處的糞便聚集，尿液渾濁，而且眼瞼周圍出現(xiàn)了粘稠的膿性分泌物。解剖已經(jīng)死亡的小鼠，可以發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)部充滿渾濁的滲出液，且腸道黏連。五天以后，活下來的小鼠狀態(tài)明顯開始好轉(zhuǎn)。假手術(shù)組小鼠術(shù)后恢復(fù)了意識(shí)顯示這一組小鼠恢復(fù)了正常狀態(tài)。

2.2 假手術(shù)組小鼠及造模組小鼠體重增長趨勢(shì)的比較結(jié)果

C組（假手術(shù)組）小鼠體重明顯高于輕型CLP造模組小鼠的體重，這顯示了C組（假手術(shù)組）小鼠可以正常進(jìn)食，隨時(shí)間推移體重穩(wěn)步上升，而造模組小鼠因?yàn)樯頎顩r變差，體內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致無法進(jìn)食，隨著時(shí)間推移導(dǎo)致體重逐漸下降甚至死亡（圖1）

圖1 假手術(shù)組及造模組小鼠體重增長趨勢(shì)

2.3 假手術(shù)組小鼠及造模組小鼠的體重在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的分析結(jié)果

C組（假手術(shù)組）的小鼠體重明顯高于A組（輕型CLP造模組），并且P＜0.01，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 假手術(shù)組小鼠及造模組小鼠的體重變化圖

2.4 假手術(shù)組小鼠及造模組小鼠血液中的內(nèi)毒素含量

為確認(rèn)CLP是否能夠誘發(fā)敗血癥，我們對(duì)C組（假手術(shù)組）及CLP模型小鼠的血液樣本進(jìn)行了內(nèi)毒素含量的測(cè)量。內(nèi)毒素濃度的測(cè)量的結(jié)果顯示。與假手術(shù)組相比，A組（輕型CLP造模組）的內(nèi)毒素水平明顯增高，并且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 假手術(shù)組及輕型造模組內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

對(duì)正常組及輕型CLP造模組小鼠的血液樣本進(jìn)行了內(nèi)毒素含量的測(cè)量。內(nèi)毒素濃度的測(cè)量的結(jié)果顯示。與C組（假手術(shù)組）相比，在B組（重型CLP造模組）小鼠中，內(nèi)毒素水平明顯增高，并且顯著高于A組（輕型CLP造模組）。且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 假手術(shù)組及重型造模組內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

綜上所述，與正常組小鼠相比，在CLP處理的模型組小鼠中（mild CLP與severe CLP），內(nèi)毒素水平均明顯增高，并且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，圖4）。數(shù)據(jù)顯示我們成功構(gòu)建了小鼠膿毒癥模型。證實(shí)了CLP引起的腹膜炎表現(xiàn)出高內(nèi)毒素水平是伴隨著豐富的膿性腹水，腸道明顯擴(kuò)張，表面的多個(gè)器官如肝臟和腎臟出血以及肺部水腫。這些觀察表明，這個(gè)CLP模型是合適的SE的病理生理學(xué)的研究。因此，進(jìn)行后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)時(shí)我們使用的模型是內(nèi)毒素陽性的CLP小鼠，是真實(shí)有效的模型。