王議鶴 王勤章 吳 雙 褚 浩 錢 成 徐 浩 錢 彪

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000）

細胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學污染和生物污染。細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染[1]。細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。本研究針對hk-2細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)霉菌污染時，對比不同濃度氟康唑處理污染的效果及細胞狀態(tài)，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 細胞污染情況

在近期用細胞時，出現(xiàn)了細胞污染現(xiàn)象。倒置顯微鏡高倍鏡可觀察到培養(yǎng)液中有黑色絲團狀物夾雜在細胞中生長，有的看似有根，其上部的黑色絲團狀物可隨培養(yǎng)液的晃動而晃動。但培養(yǎng)液澄清，未發(fā)生渾濁，細胞生長緩慢[2，3]。

1.2 方法

（1）培養(yǎng)方法

在無菌條件下將受污染的細胞培養(yǎng)液100 p。涂布于PDA平板，300 C倒置培養(yǎng)72 h，觀察其菌落形態(tài)。

（2）污染的去除

吸棄受污染的舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶兩遍，用10%及20%濃度氟康唑進行清除，1次/d，持續(xù)10 d，同時每天鏡下仔細觀察細胞生長情況。

2 結(jié)果

2.1 污染類型的初步鑒別結(jié)果

72 h后，平板上生長出直徑約2～3 mm表面濕潤、粘稠且隆起的圓形乳白色菌落，懷疑為酵母菌。用接種環(huán)取少量疑似為酵母菌的菌體，置于載玻片中英的無菌生理鹽水中，加蓋玻片。在高倍鏡下觀察，多數(shù)為5～10 pm的卵圓形單細胞，部分有出芽現(xiàn)象。

2.2 藥物處理結(jié)果細胞

經(jīng)1次/d的沖洗、換液、不同濃度氟康唑處理后，污染得到明顯的控制，鏡下觀察黑色絲團狀物逐日減少，細胞生長趨勢尚可，未發(fā)現(xiàn)有異常現(xiàn)象。加藥過程中可正常傳代，持續(xù)10 d后，鏡下已無真菌生長，細胞生長良好，可用于試驗，與正常未受污染的細胞無明顯差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 污染類型

細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染[4]。其中，細菌方面，細菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培養(yǎng)液一般會在短時間內(nèi)變黃，有時靜置的培養(yǎng)液不混，稍加震蕩會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素，能夠預防絕大多數(shù)的細菌污染。真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其臨近梅雨季節(jié)，細胞培養(yǎng)時更易污染。污染細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠[5]；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。真菌生長的比較慢，不容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)就表明細胞被污染了，也很難救活。支原體的大小介于細菌和病毒之間，是一種獨立生活的微生物。對熱敏感，對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細胞微絨毛相似。因國內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測，而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一。支原體污染細胞后，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁，但細胞變化不顯著，隨著細胞的培養(yǎng)會慢慢死亡。DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

3.2 污染處理

污染是細胞培養(yǎng)的大敵，預防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關(guān)鍵之一。危機意識要貫徹實驗的始終，否則不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。本次研究中，經(jīng)1次/d的沖洗、換液、不同濃度氟康唑處理后，污染得到明顯的控制，鏡下觀察黑色絲團狀物逐日減少，細胞生長趨勢尚可，未發(fā)現(xiàn)有異常現(xiàn)象。加藥過程中可正常傳代，持續(xù)10 d后，鏡下已無真菌生長，細胞生長良好，可用于試驗，與正常未受污染的細胞無明顯差異。氟康唑又名大扶康，是一種新型三唑類抗真菌藥物，有廣譜抗真菌作用，對真菌細胞色素P-450依賴酶的抑制作用具有高度選擇性，能選擇性地抑制真菌的甾醇合成。一旦發(fā)生真菌污染且污染細胞的價值較大，可選用10%的氟康唑氯化鈉注射液加以去除，污染得到控制后還應(yīng)在不加藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否已被消除[5]。實驗表明，氟康唑能有效的抑制細胞培養(yǎng)基中真菌的生長和繁殖，而且在有效抑菌濃度范圍內(nèi)氟康唑?qū)毎麩o明顯毒性，可應(yīng)用于細胞培養(yǎng)，去除細胞培養(yǎng)過程中真菌污染。

污染重在預防，預防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法，能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預防可從以下幾方面著手：（1）從操作者做起操作者責任心要強，要細心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5 min，按規(guī)定穿隔離衣。進入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。（2）從物品、用品消毒滅菌著手細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。（3）防止細胞交叉污染。在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，最好做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時易發(fā)生混亂。在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復蘇，重新培養(yǎng)。

綜上所述，采用10%及20%濃度氟康唑進行清除，細胞生長良好，可用于試驗，與正常未受污染的細胞無明顯差異，10%濃度氟康唑既能滅菌又不對細胞造成影響。

[1] 呂春榮，李衛(wèi)娟，權(quán)國波，等.云南半細毛羊毛囊干細胞微生物污染檢測[J].中國草食動物科學，2014，34（6）：46-48.

[2] 董雙，何劍斌，關(guān)心，等.流式細胞術(shù)在霉菌毒素研究中的應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（12）：258-262.

[3] 朱冰冰，遲楊峰，王浩，等.普羅布考抑制氧化低密度脂蛋白誘導的人腎近曲小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的作用及機制研究[J].臨床腎臟病雜志，2015，15（10）：620-625.

[4] 何平，李丹，李德天，等.乙肝病毒X蛋白通過激活JAK2/STAT3信號通路調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞凋亡[J].中國病理生理雜志，2014，30（8）：1451-1460.

[5] 李慧，胡夢龍，蔡軍，等.小麥粉污染霉菌的分離鑒定及產(chǎn)黃曲霉毒素能力的研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2015，8（9）：3447-3452.