（廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510663）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬附生多年生草本植物，是傳統(tǒng)中草藥植物，具有生津養(yǎng)胃、滋陰清熱、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，富含石斛多糖、生物堿、氨基酸、類(lèi)黃酮、酚酸等對(duì)人體有益的天然藥物活性物質(zhì)[1-2]。其中酚酸（Phenolic acids）是指結(jié)構(gòu)中含有活潑氫供體的酚羥基有機(jī)酸[3-5]，主要為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，比如香草酸、丁香酸、沒(méi)食子酸、香豆酸、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸等。研究表明酚酸具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、抗紫外線(xiàn)輻射等功效[6-8]。因此進(jìn)一步探明鐵皮石斛中對(duì)健康起促進(jìn)功效的酚酸類(lèi)物質(zhì)組成及其含量具有重要意義。

目前酚酸的測(cè)定方法有毛細(xì)管電泳法[9]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）[14-17]，研究對(duì)象主要為蔬菜[1]、水果[8]、水稻[10]等，但關(guān)于鐵皮石斛中酚酸類(lèi)物質(zhì)組成及其含量的報(bào)道較少。本研究針對(duì)10份不同產(chǎn)地的鐵皮石斛，采用甲醇超聲萃取，Oasis HLB固相萃取柱凈化，Hypersil BDS C18色譜柱分離，二極管列陣檢測(cè)器測(cè)定，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定13種酚酸類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法，該法簡(jiǎn)便、高效、靈敏、準(zhǔn)確，可為鐵皮石斛酚酸組成鑒定及質(zhì)量研究提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　儀器、試劑、材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；MM400型研磨儀：德國(guó)RETSCH公司；Milli-Q Integral型超純水機(jī)：美國(guó)Mill-pore公司；BRC-100A 30L型超聲波清洗器：鄭州渤銳超聲波設(shè)備有限公司；BS224S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司。

13種酚酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：沒(méi)食子酸、原兒茶酸、N-p-香豆酰酪胺、松柏醇、二氫阿魏酰酪胺、丁香酸、丁香醛、香草酸、對(duì)羥基苯丙酸、對(duì)羥基桂皮酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、3-羥基肉桂酸（純度均大于98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，具體信息見(jiàn)表1。乙腈、甲醇（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；甲酸、乙酸銨（色譜純）：美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的酚酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用80%甲醇溶液配制成濃度為1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4℃保存。

表1　13種酚酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息表Table 1　Information table of 13 kinds of phenolic acids

10份不同產(chǎn)地的鐵皮石斛，產(chǎn)地分別為安徽（大別山）、浙江（鄞縣、天臺(tái)、仙居）、福建（寧化）、廣西（天峨）、四川（合江）、云南（石屏、文山、麻栗坡），樣品經(jīng)粉碎后，過(guò)200目篩，備用。

1.2　液相色譜條件

色譜柱：HypersilBDSC18（3.0μm，4.6mm×150mm）；流動(dòng)相：10 mmol/L醋酸銨溶液（A）和甲醇溶液（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260、280、320 nm；柱溫：40℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

表2　洗脫梯度程序Table 2　The mobile phase gradient program of HPLC

1.3　樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g樣品（精度至0.1mg）于100 mL離心管中，加入20 mL 80%甲醇溶液（含有1%抗壞血酸），振蕩混勻后，室溫下超聲（300 W，40 KHz）提取30 min；加入10 mL 4mol/L NaOH溶液，充入N2后密封，37℃恒溫振蕩水解2 h（200 r/min）后，加入10 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2。加入20 mL乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用6 mL 80%甲醇溶液溶解后，Oasis HLB固相萃取柱凈化，凈化后經(jīng)0.22 μm有機(jī)過(guò)濾頭過(guò)濾，濾液供液相色譜分析。

1.4　標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

分別移取1 000 μg/mL酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容，配制濃度分別為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL 的酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，建立線(xiàn)性回歸方程。

2　結(jié)果與討論

2.1　檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)13種酚酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行紫外線(xiàn)掃描（190 nm～700 nm），得到13種酚酸類(lèi)物質(zhì)的最大紫外吸收光波長(zhǎng)。為了獲得較大的紫外吸收峰，并減少干擾，GA、PD、VA、HCA、HA 選擇 260 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，紫外吸收較大，且干擾較?。籘FT和HAD選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，紫外吸收較大，無(wú)雜峰干擾；PA、CA、SA、DH、HP、FA 選擇 320 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在260、280、320 nm 3種檢測(cè)波長(zhǎng)下，13種酚酸類(lèi)物質(zhì)可獲得較好的色譜分離效果，紫外吸收較大、干擾小，且基線(xiàn)分離（圖1）。

2.2　色譜柱的選擇

考察了 poroshell 120 EC-C18、BEH C18、Penomenex C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C8等不同微粒填料的色譜柱對(duì)13種酚酸的分離效果（圖1）。

從圖1中可知：在260、280、320 nm 3種檢測(cè)波長(zhǎng)下，13種酚酸在Hypersil BDS C18色譜柱上分離效果較好，峰形尖銳且對(duì)稱(chēng)，故選擇Hypersil BDS C18作為分析色譜柱。

2.3　流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙酸銨-甲醇、磷酸二氫鉀-甲醇等流動(dòng)相對(duì)13種酚酸色譜分離的影響。結(jié)果表明，以甲醇-水、乙腈-水和磷酸二氫鉀-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，部分色譜峰拖尾，13種酚酸化合物的色譜峰不能實(shí)現(xiàn)有效分離，單個(gè)化合物出現(xiàn)雙峰；以乙酸銨-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，表現(xiàn)出較好的分離和洗脫能力，當(dāng)乙酸銨濃度為10 mmol/L時(shí)，13種酚酸的色譜峰可得到較好的分離，基線(xiàn)平穩(wěn)且色譜峰峰形尖銳對(duì)稱(chēng)（圖1）。因此選擇乙酸銨-甲醇作為流動(dòng)相。

圖1　13種酚酸標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖Fig.1　Chromatograms of 13 standard phenolic acid

2.4　萃取溶劑的選擇

考察了甲醇、乙腈、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷等有機(jī)溶劑對(duì)13種酚酸的萃取效果（圖2）。

從圖2可以看出：按13種酚酸平均萃取率高低順序排列為：乙酸乙酯（96.4%）＞甲醇（86.7%）＞二氯甲烷（79.3%）＞正己烷（71.5%）＞乙腈（68.1%）＞乙醇（63.4%），其中乙酸乙酯對(duì)13種酚酸的萃取率在88.4%～99.2%之間，平均值為96.4%。故選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

圖2　萃取溶劑對(duì)酚酸萃取效果的影響Fig.2　Effect of extraction solvent on the effect of phenolic acid extraction

2.5　凈化柱的選擇

考察了陰離子柱Oasis MAX、弱陰離子柱Oasis WAX、陽(yáng)離子柱Oasis MCX、弱陽(yáng)離子柱Oasis WCX、親水-親酯柱Oasis HLB等不同極性固相萃取柱對(duì)13種酚酸的凈化效果（圖3）。

圖3　固相萃取柱對(duì)酚酸凈化回收率的影響Fig.3　Effect of solid phase extraction column on the recovery rate of phenolic acid extraction

從圖3中可知，親水-親酯柱Oasis HLB凈化回收效果較好，平均凈化回收率為94.6%，這可能是由于Oasis HLB屬于親水-親酯固相萃取柱，對(duì)各種極性、非極性物質(zhì)都有均衡吸附作用。故選擇Oasis HLB作為固相萃取凈化柱。

2.6　基質(zhì)效應(yīng)

以鐵皮石斛空白提取液作為13種酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，按照“1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制”配制一系列酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制鐵皮石斛基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將其斜率與空白基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率相比，斜率比值在84.7%～93.6%之間。這表明鐵皮石斛基質(zhì)中部分酚酸存在略微的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

2.7　線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限

在樣品中添加不同濃度的酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2液相色譜條件”進(jìn)行測(cè)定，以酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），信號(hào)響度峰面積為縱坐標(biāo)（A，mAu），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性回歸方程；以信噪比（S/N=3）計(jì)算方法檢出限（LOD），以信噪比（S/N=10）計(jì)算方法定量限（LOQ）（表3）。

表3　線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（n=6）Table 3　Linear range，regression equations，correlation coefficients and limits of detection（n=6）

從表3中可知：在 0.5 μg/mL～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（R2≥0.999 6）；LOD 在 0.07mg/kg～0.3mg/kg之間；LOQ在0.2mg/kg～1.0mg/kg之間。

2.8　回收率與精密度

分別在鐵皮石斛樣品中添加0.5、25.0、50.0 μg/mL 3種水平的酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加標(biāo)回收率與精密度（n=6）Table 4　Recovery and precision（n=6）

續(xù)表4　加標(biāo)回收率與精密度（n=6）Continue table 4　Recovery and precision（n=6）

由表4可知，13種酚酸的加標(biāo)回收率在86.7%～102.3%之間，RSD在1.1%～3.5%之間，由此可見(jiàn)，該方法的準(zhǔn)確度、精密度均能滿(mǎn)足方法學(xué)的要求。

2.9　實(shí)際樣品的檢測(cè)

將10份來(lái)自不同產(chǎn)地的鐵皮石斛樣品，按本文所建立的高效液相色譜法測(cè)定鐵皮石斛中13種酚酸類(lèi)物質(zhì)組成及其含量（表5）。

結(jié)果顯示：1）鐵皮石斛中共檢出12種酚酸，松柏醇未檢出，這也許說(shuō)明鐵皮石斛中不含有松柏醇；所檢出的12種酚酸中，阿魏酸含量最高（含量在187.3mg/kg～423.7mg/kg 之間，平均值 293.9mg/kg），其次是丁香酸、二氫阿魏酰酪胺、對(duì)羥基苯甲酸，這些酚酸類(lèi)物質(zhì)可能與鐵皮石斛的抗氧化作用、增強(qiáng)免疫力、降血糖等功效有關(guān)，這為研究與開(kāi)發(fā)鐵皮石斛活性物質(zhì)提供參考。2）來(lái)源不同的10份鐵皮石斛樣品中，酚酸類(lèi)成分和含量均存在差異，這種差異可能是由于品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏時(shí)間等差異引起的，但這種差異作為鐵皮石斛品種鑒定、真?zhèn)舞b別以及藥材品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

表5　實(shí)際樣品中酚酸組成及其含量Table 5　Composition and content of phenolic acids in real samplesmg/kg

3　結(jié)論

針對(duì)10份不同產(chǎn)地的鐵皮石斛，采用甲醇超聲萃取，Oasis HLB固相萃取柱凈化，Hypersil BDS C18色譜柱分離，二極管列陣檢測(cè)器測(cè)定，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定13種酚酸類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法。結(jié)果表明：在 0.5 μg/mL～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（R2≥0.999 6）；LOD 在 0.07mg/kg～0.3mg/kg 之間；LOQ在0.2mg/kg～1.0mg/kg之間；加標(biāo)回收率在86.7%～102.3%之間，RSD在1.1%～3.5%之間；鐵皮石斛中共檢出12種酚酸，阿魏酸含量最高，其次是丁香酸、二氫阿魏酰酪胺、對(duì)羥基苯甲酸，這些酚酸可能與鐵皮石斛的抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降血糖等功效有關(guān)，這將為鐵皮石斛活性物質(zhì)研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]李娟,李順祥,黃丹,等.鐵皮石斛資源、化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報(bào),2011,29(18):74-79

[2]李燕,王春蘭,王芳菲,等.鐵皮石斛中的酚酸類(lèi)及二氫黃酮類(lèi)成分[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2010,45(13):975-979

[3]喬麗萍,傅瑜,葉興乾,等.酚酸生物活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,13(10):144-152

[4]宋亞玲,王紅梅,倪付勇,等.金銀花中酚酸類(lèi)成分及其抗炎活性研究[J].中草藥,2015,46(4):490-495

[5]倪付勇,劉露,宋亞玲,等.金銀花中抗補(bǔ)體活性酚酸類(lèi)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2015,40(2):269-274

[6]Choi K C,Son Y O,Hwang J M,et al.Antioxidant,anti-inflammatory and anti-septic potential of phenolic acids and flavonoid fractions isolated from Lolium multiflorum.[J].Pharmaceutical Biology,2017,55(1):611-619

[7]張翠,劉占云,於洪建,等.黑豆種皮的酚酸類(lèi)成分研究[J].中草藥,2013,44(24):3440-3443

[8]劉麗金,周萍.核桃殼中酚酸的提取及含量測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2017,38(20):55-60

[9]王蕎薇,謝媛媛,王義明,等.銀杏葉中銀杏酚酸類(lèi)成分含量測(cè)定方法研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2015,50(2):167-173

[10]謝越,俞浩,汪建飛,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定滁菊樣品中的9種酚酸[J].分析化學(xué),2013,41(3):383-388

[11]孫崇臻,王超,蔡子哲,等.高效液相色譜測(cè)定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸[J].食品科學(xué),2013,34(10):281-285

[12]洪燕,韓燕全,夏倫祝,等.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地蒼耳子9種酚酸類(lèi)成分的含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2013,48(13):1109-1112

[13]張娜,王國(guó)祥,Abacar Jose Daniel,等.超高效液相色譜法分析稻米酚酸化合物組分及其含量[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(9):1718-1726

[14]Regnault-Roger C,Hadidane R,Biard J F,et al.High performance liquid and thin-layer chromatographic determination of phenolic acids in palm(Phoenix dactilifera)products[J].Food Chemistry,2017,25(1):61-71

[15]Lee J,Chan B L S,Mitchell A E.Identification/quantification of free and bound phenolic acids in peel and pulp of apples(Malus domestica)using high resolution mass spectrometry(HRMS)[J].Food Chemistry,2017,215:301-310

[16]Huang Y,Sun H Y,Qin X L,et al.A UPLC-MS/MS Method for Simultaneous Determination of Free and Total Forms of a Phenolic Acid and Two Flavonoids in Rat Plasma and Its Application to Comparative Pharmacokinetic Studies of Polygonum capitatum Extract in Rats[J].Molecules,2017,22(3):353-365

[17]Szewczyk K,Olech M.Optimization of extraction method for LC–MS based determination of phenolic acid profiles in different Impatiens,species[J].Phytochemistry Letters,2017,20(6):322-330