豆康寧，孟宏昌，王飛，*

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002；2.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南漯河462002）

甘草為多年生草本植物，是一種藥食兩用資源，其提取物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域[1]。甘草具有瀉火解毒、緩急止痛、散表寒、補(bǔ)中益氣、調(diào)和藥性、解百藥之毒作用[2]。甘草中的生理活性成分主要有三萜類化合物、黃酮類化合物及甘草多糖類化合物三大類成分，具有抑菌、抗腫瘤、抗誘變、抗病毒、抗氧化等多種生理功能[3-8]。我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，甘草，甘草酸銨，甘草酸一鉀及三鉀作為功能甜味劑可用于食品中，使用量按生產(chǎn)需要使用。

但是，甘草具有較重的甘草腥味，會影響食品的感官品質(zhì)，限制了其在食品中的應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵法是改良甘草感官品質(zhì)的良好途徑[9]。該文應(yīng)用乳酸菌和酵母菌二次發(fā)酵工藝，研制甘草發(fā)酵飲料，并評價其清咽功能。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

甘草：品種為烏拉爾甘草，生長方式為種植，產(chǎn)地為寧夏鹽池，生長期3年，通過市售采購；復(fù)合乳酸菌[（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1），活菌數(shù)為1×1012個/g]、酵母菌[活性面包干酵母，活菌數(shù)為 1×1012個/g]：安琪酵母股份有限公司；甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，西安匯林生物科技有限公司；甲醇：色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；醋酸銨、乙酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；地塞米松：廣西萬德藥業(yè)股份有限公司；SPF級小白鼠（BALB/C）：湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司；SPF級大白鼠（SD）：湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

YP3001N型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SZYDW型無菌操作臺：蘇州億達(dá)凈化實驗室設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；RYC-111型搖床：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；X-22R型冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；LC1260高壓液相色譜儀（HPLC）、100Conc紫外可見分光光度計、7890A氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測器，F(xiàn)ID）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1　甘草發(fā)酵飲料的制備工藝

甘草發(fā)酵飲料的制備工藝：甘草混合液制備→甘草混合液乳酸菌發(fā)酵→甘草混合液酵母菌發(fā)酵→離心分離→滅菌。

1.3.1.1　甘草混合液的制備方法

將甘草用萬能粉碎機(jī)粉碎成20目的粉末，稱量20 g甘草樣品，放入1 000 mL錐形瓶中，再加入200 mL水，放入搖床中，搖床振蕩速度120 r/min，溫度為30℃，提取60 min，得甘草混合液。

1.3.1.2　甘草混合液乳酸菌發(fā)酵方法

在250 mL錐形瓶中，加入100 mL甘草混合液，添加3%的葡萄糖，搖勻后，在高壓滅菌鍋中滅菌，待甘草混合液冷卻后，在無菌操作臺中接種甘草混合液1.5%的乳酸菌，封好瓶口，然后放置在恒溫?fù)u床中發(fā)酵，發(fā)酵溫度40℃[10]。制作多瓶樣品，每隔2小時取出一瓶樣品，離心分離取上清液，測定pH值和總酸度，評價甘草混合液的感官品質(zhì)。

1.3.1.3　甘草混合液酵母菌發(fā)酵方法

在乳酸菌發(fā)酵液中，添加3%的葡萄糖，接種甘草混合液2%的酵母菌，然后放置在恒溫?fù)u床中發(fā)酵，發(fā)酵溫度35℃[10]。每隔30分鐘，取出部分甘草發(fā)酵溶液，離心分離取上清液，測定乙醇濃度，評價甘草溶液的感官品質(zhì)。

1.3.1.4　離心分離

將發(fā)酵后的甘草混合液離心分離，轉(zhuǎn)速5000r/min，時間10 min。

1.3.1.5　殺菌方法

將離心分離所得上清液，進(jìn)行殺菌，溫度85℃，時間30 min，即得甘草發(fā)酵飲料。

1.3.2　甘草感官品質(zhì)評價方法

選擇12名優(yōu)秀飲料感官評價員，并將這12位訓(xùn)練好的評價員組成感官評定小組。樣品采用隨機(jī)編碼，常溫下進(jìn)行品評。鑒別時需避免混雜外來氣味并不斷漱口以保持口腔清爽，取平均值為感官品質(zhì)評價結(jié)果。感官評定賦分標(biāo)準(zhǔn)參考見表1[11]。其中，以10%的甘草提取液的腥味等級標(biāo)定為重，將甘草液濃度依次稀釋10倍，腥味等級依次為較重、稍有甘草腥味，無甘草腥味。

表1　甘草溶液感官品質(zhì)評價賦分標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Evaluation criteria for sensory quality of glycyrrhiza solution

1.3.3　甘草酸的測定方法

甘草酸的測定方法參照中華人民共和國衛(wèi)生部GB/T 22248-2008《保健食品中甘草酸的測定》進(jìn)行。

1.3.4　甘草溶液pH值和總酸度的測定

采用pH計測定甘草溶液pH值，采用酸堿滴定法測定甘草溶液的總酸度。具體操作方法見參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.5　甘草混合液中乙醇含量的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用Agilent 7890A氣相色譜儀測定乙醇含量，色譜分析條件見參考文獻(xiàn)[13]。用水分別配置以下不同濃度的乙醇溶液：2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.625%，建立乙醇濃度與氣相色譜出峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6　清咽功能評價

清咽功能評價方法根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的文件“國食藥監(jiān)?；痆2012]107號、附件9《清咽功能評價方法》”進(jìn)行。

1.3.6.1　小白鼠耳廓腫脹實驗

采用60只小白鼠，雄性，體重為18 g～20 g，分為5組，分別是生理鹽水空白組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每天按照0.02 mL/g的劑量進(jìn)行灌胃小白鼠30 d，陽性對照組服用地塞米松，其中地塞米松濃度為0.05%，甘草發(fā)酵飲料按照清咽功能有效標(biāo)志成分甘草酸計，將飲料濃縮為低劑量組甘草酸含量0.3%、中劑量組甘草酸含量0.6%、高劑量組甘草酸含量1.2%。

耳廓腫脹率/%=耳廓腫脹值/空白組耳片重量×100。

1.3.6.2　大白鼠肉芽腫實驗

采用60只大白鼠，雄性，體重為180 g～200 g，分為5組，分別是生理鹽水空白組、地塞米松陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每天按照0.02 mL/g的劑量進(jìn)行灌胃大白鼠30 d，陽性對照組服用地塞米松，其中地塞米松濃度為0.05%，甘草發(fā)酵飲料按照清咽功能有效標(biāo)志成分甘草酸計，將飲料濃縮為低劑量組甘草酸含量0.15%、中劑量組甘草酸含量0.3%、高劑量組甘草酸含量0.6%。

肉芽腫凈量/mg=干燥后棉球肉芽腫重量-原棉球重量。

1.3.6.3　人體試食實驗

篩選有慢性咽炎人群，其中空白組50人，試食組50人，每天食用量按照體重為0.02 mL/g，空白組為純凈水，試食組為甘草發(fā)酵飲料，其中，甘草發(fā)酵飲料按照清咽功能有效標(biāo)志成分甘草酸計為0.06%（為小白鼠耳廓腫脹實驗中劑量的10%，或者大白鼠肉芽腫實驗中劑量的20%），試食周期30 d。

2　結(jié)果與分析

2.1　甘草在發(fā)酵過程中感官品質(zhì)的變化

甘草溶液在乳酸菌發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵發(fā)酵過程中感官品質(zhì)變化見表2所示。

表2　甘草溶液在發(fā)酵過程中感官品質(zhì)的變化Table 2　Changes of sensory quality during the fermentation of glycyrrhiza solution

甘草溶液感官品質(zhì)隨著乳酸菌發(fā)酵時間的延長先上升后下降，發(fā)酵8 h時，甘草溶液感官品質(zhì)最好，此時甘草溶液的腥味大部分消失，變成具有爽口的乳酸酸味[14]。發(fā)酵時間超過8 h后，酸味變得較重，口感變得較差。甘草溶液感官品質(zhì)隨著酵母菌發(fā)酵時間的延長先上升后下降，發(fā)酵2 h時，甘草溶液感官品質(zhì)最好，甘草提取液的腥味消失，變成具有乙醇的殺口感[15]，腥氣味消失，變成酒香味。發(fā)酵時間超過2 h后，口感中乙醇味比較明顯，具有一定的刺激感，感官品質(zhì)變差。甘草提取混合溶液經(jīng)過乳酸菌和酵母菌二次發(fā)酵工藝后，產(chǎn)生酸類物質(zhì)而具有酸味，同時溶解了甘草中的甘草酸而具有甜味，因此，該甘草發(fā)酵液經(jīng)過離心過濾后，具有適口的酸甜味，無需進(jìn)一步調(diào)配糖酸比。

2.2　甘草在乳酸菌發(fā)酵過程中pH值和總酸度的變化

甘草溶液在乳酸菌發(fā)酵過程中pH值和總酸度的變化見圖1。

圖1　甘草溶液在乳酸菌發(fā)酵過程中pH值和總酸度的變化Fig.1　Changes of pH and the total acidity during the fermentation of glycyrrhiza solution by lactobacillus

由圖1可知，甘草溶液pH值隨著乳酸菌的發(fā)酵不斷下降，總酸度不斷增加。pH值和總酸度在發(fā)酵初期變化幅度較小，發(fā)酵中期變化幅度較大，發(fā)酵后期則變化幅度又變小。發(fā)酵12 h后，pH值下降到3.8，總酸度上升到2.1 g/L。這主要由乳酸菌發(fā)酵過程中，產(chǎn)生酸類物質(zhì)積累的結(jié)果[16]。

2.3　甘草在酵母菌發(fā)酵過程中乙醇含量的變化

乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為Y=12 648.029 9X-91.032 609，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 98。甘草溶液在酵母菌發(fā)酵的過程中，乙醇含量的變化見圖2所示。

圖2　甘草溶液在酵母菌發(fā)酵過程中乙醇含量的變化Fig.2　Changes of alcohol during the fermentation of glycyrrhiza solution by yeast

由圖2可知，甘草提取液在酵母發(fā)酵的過程中，開始發(fā)酵時，乙醇含量增加幅度較小，發(fā)酵1 h后，乙醇含量增加幅度較大。這是由于酵母在前期發(fā)酵主要以有氧呼吸為主，產(chǎn)生水和二氧化碳。發(fā)酵后期，溶液中氧氣消失，酵母菌以無氧發(fā)酵為主，產(chǎn)生乙醇和二氧化碳[17]。

2.4　甘草發(fā)酵飲料清咽功能

2.4.1　甘草發(fā)酵飲料小白鼠耳廓腫脹實驗

甘草發(fā)酵飲料小白鼠耳廓腫脹實驗結(jié)果見表3。

表3　甘草發(fā)酵飲料小白鼠耳廓腫脹實驗結(jié)果Table 3　Experimental results of mice auricle edema of glycyrrhiza fermented beverage

小白鼠耳廓腫脹實驗原理是：二甲苯為無色澄清液體，涂抹于小鼠耳廓后，由于其刺激作用，可引起鼠耳局部毛細(xì)血管充血，通透性增加，導(dǎo)致急性炎癥。比較實驗組和對照組（空白組）二甲苯作用后耳腫脹率的差異，以確定甘草發(fā)酵飲料是否具有干預(yù)急性炎癥（小鼠耳腫脹）的作用。通過表3的實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計結(jié)果可知，陽性對照組、中劑量組和高劑量組具有顯著抑制小白鼠耳廓腫脹作用，而低劑量組無顯著抑制小白鼠耳廓腫脹作用。

2.4.2　甘草發(fā)酵飲料大白鼠肉芽腫實驗

甘草發(fā)酵飲料大白鼠肉芽腫實驗結(jié)果見表4。

表4　甘草發(fā)酵飲料大白鼠肉芽腫實驗結(jié)果Table 4　Experimental results of rats granuloma of glycyrrhiza fermented beverage

大白鼠肉芽腫實驗原理是：采用棉球作為異物植入動物局部皮下，可引起與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽組織增生。比較給予受試樣品后，實驗組動物與對照組（空白組）動物肉芽腫重量的差異，以確定受試樣品是否具有干預(yù)慢性炎癥（肉芽腫形成）的作用。通過表4的實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計結(jié)果可知，陽性對照組、中劑量組和高劑量組具有顯著的抑制大白鼠肉芽腫生成作用，而低劑量組無顯著的抑制大白鼠肉芽腫生成作用。

2.4.3　甘草發(fā)酵飲料人體試食實驗

甘草發(fā)酵飲料人體試食實驗結(jié)果見表5。

表5　甘草發(fā)酵飲料人體試食實驗結(jié)果Table 5　Experimental results of human body feeding of glycyrrhiza fermented beverage

清咽功能人體試食實驗原理是：試食組自身比較及試食組與對照組組間比較，咽部臨床癥狀、體征積分明顯降低，且癥狀、體征改善率較對照組有明顯增加，差異有顯著性，可判定該受試樣品具有清咽功能。通過表5的實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計結(jié)果可知，試食組自身有效率為92%，與對照組相比，有效率增加86%，而且效果顯著。

動物實驗和人體實驗結(jié)果顯示：當(dāng)甘草發(fā)酵飲料中清咽功能成分甘草酸含量達(dá)到中劑量組含量時，小白鼠耳廓腫脹實驗和大白鼠肉芽腫實驗具有顯著性（P＜0.05）；人體服用甘草酸含量達(dá)到0.06%時，對照組和甘草發(fā)酵飲料清咽功能差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，本甘草發(fā)酵飲料具有清咽功能。

3　結(jié)論

10%的甘草溶液，添加1.5%的乳酸菌、3%的葡萄糖，在40℃發(fā)酵8 h；然后添加2%的酵母菌、3%的葡萄糖，在35℃發(fā)酵2 h，甘草腥味消失，甘草溶液感官品質(zhì)良好。甘草發(fā)酵飲料中甘草酸含量達(dá)到0.06%時，具有清咽功能。

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