佘銀，李跑，高婉茹，黃昭，劉霞

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410000）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝綜合征，它與多種器官損傷和功能障礙有關，并已成為全球慢性非傳染性疾病中最普遍的一種疾病[1-3]。至2040年，糖尿病患者人數(shù)將達到6.42億人[4]。其中，2型糖尿?。╠iabetes mellitus，type 2，T2D）占全球糖尿病病例總數(shù)的90%以上。目前，控制餐后高血糖是治療T2D的一個主要方式[5-6]。而食物中碳水化合物的消化是餐后血糖升高最主要的原因。由于日常生活中人們攝食的主要碳水化合物為淀粉，而淀粉的“質(zhì)”和“量”直接影響著血糖的調(diào)節(jié)。因此，可以通過增強淀粉的抗性，降低和延緩淀粉的消化來控制人體餐后血糖的升高。

黃酮類化合物廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉和藥用植物中，是一類具有多種生物活性的物質(zhì)，如抗氧化、防癌、抗癌、抗炎等活性[7-8]。研究表明，黃酮類化合物可在口腔和胃腸道中抑制淀粉酶的催化活性，阻礙食品和消化過程中碳水化合物的水解，從而有效地降低餐后血糖水平，達到預防和輔助治療糖尿病的效果[9]。野菊花作為一種傳統(tǒng)的中藥，已經(jīng)被使用了好幾個世紀[10]。野菊花中含有大量黃酮類化合物，主要包括蒙花苷、刺槐素和木犀草素[11]（圖1）。

圖1　蒙花苷、刺槐素和木犀草素的化學結(jié)構Fig.1　Chemical structures of buddleoside，acacetin，luteolin

在野生菊花的質(zhì)量控制方面，也是以這3種化合物的含量為標準[11]。目前，對野菊花的研究和利用主要為消除風和熱，去除肝臟熱毒[12]，很少有關于野菊花黃酮降血糖作用的研究，野菊花黃酮和淀粉相互作用的研究就更少。研究野菊花黃酮和淀粉的相互作用，一方面有助于了解淀粉理化性質(zhì)以及野菊花黃酮調(diào)節(jié)餐后血糖水平的途徑與能力。另一方面，也為野菊花在食品工業(yè)和保健食品工業(yè)中的應用提供了有益的參考。表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance，SPR）是評價分子間相互作用的最有力技術之一，本研究利用SPR傳感器研究了3種野菊花黃酮與淀粉的實時動力學分析，分別獲得了3種黃酮與淀粉相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka、解離常數(shù)Kd和平衡解離常數(shù)KD。在此基礎上，研究了3種野菊花黃酮對淀粉消化的影響。并且探討了淀粉對野菊花黃酮抗氧化活性的影響。通過對上述3方面的研究，探究這3種野菊花黃酮與淀粉作用的構效關系。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

蒙花苷（純度：99.37%）、刺槐素（純度：99.8%）和木犀草素（純度：98.92）：中國檢定研究院；枯草桿菌α-淀粉酶、可溶性淀粉和阿卡波糖：長沙隆和化玻實驗用品有限公司；巰基丙酸（3-Mercaptopropionic，MPA）、N-羥基丁二酰亞胺 （n-hydroxysuccinimide，NHS）、碳二亞胺（1-ethyl-3-（3-dimethylami-nopropy1）carbodiimide，EDC）：美國 Sigma-Aldrich 公司；常用試劑：國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2　儀器與設備

分析天平（AUY220）：日本島津；pH計（Testo205）：德國儀器國際貿(mào)易上海有限公司；超聲波清洗器（KQ-100）：昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S28）：上海精宏實驗設備有限公司；全波長酶標儀（Multisk Go1510）：芬蘭；表面等離子體共振儀（BISPR-2000）：美國 Biosensing Instrument。

1.3　方法

1.3.1　MPA在傳感器芯片表面的自組裝

依據(jù)文獻介紹的步驟[13]，取出全新金片，無水乙醇浸泡5 min后，用超純水清洗數(shù)次，氮氣吹干，將其安裝在SPR傳感器棱鏡上，隨后安裝好流通池，通入（10 mmol/L、pH6）磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，PBS）作為載液，試驗過程中流速為10 μL/min。待基線平穩(wěn)后，利用氨基偶聯(lián)的方法，通入100 μL、10 mmol/L MPA溶液，使MPA在傳感器表面進行自組裝，形成自組裝的單分子膜（MPA一端的巰基連在金片上，另一端的羧基露在外側(cè)）。然后通入100 μL、0.4 mol/L/0.1mol/L EDC/NHS混合溶液，活化MPA中的游離的羧基。

1.3.2　淀粉在傳感器芯片表面固定的最佳濃度

稱取3.4mg淀粉，加入1 mL煮沸的超純水，使其完全溶解。用PBS稀釋成系列濃度（10、20、40、80、160、240、300、400、500μmol/L）。調(diào)節(jié)SPR流速為10μL/min，將淀粉溶液（低溶度→高濃度）依次通入已活化的傳感器芯片上，記錄SPR響應信號。繪制不同濃度淀粉溶液與SPR響應信號之間的工作曲線，找到淀粉的最佳固定濃度。每個濃度淀粉溶液進行3次平行試驗，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3　3種黃酮與淀粉相互作用的SPR分析

在傳感器芯片表面固定最佳濃度的淀粉溶液之后，向流通池通入系列梯度濃度的黃酮溶液（100、200、400、800 μmol/L），進行 SPR 檢測，反應時間約為 600 s。每次反應完成后用2 mmol/L NaOH進行再生，進行下一濃度試驗，每個濃度平行3次。繪制黃酮與淀粉相互作用的實時動力曲線圖，獲得SPR響應信號。并且通過SPR自帶軟件（version 2.2.0）對動力學曲線進行擬合，得到3種黃酮與淀粉相互作用的動力學常數(shù)。

1.3.4　野菊花黃酮對淀粉消化的影響

參考文獻[14]，本試驗分對照組和抑制劑組。對照組的具體操作如下：取2 mL、0.1 mol/L淀粉懸浮液，加入 0.05 mL、300 μmol/L 酶溶液，37 ℃下消化 5 min后，馬上加入0.5 mL、0.01 mol/L碘應用液終止反應，搖勻后560 nm處測其吸光度。抑制劑組：取2 mL、0.1 mol/L淀粉懸浮液，分別加入0.5 mL不同濃度（10、50、100 μmol/L）的蒙花苷、刺槐素和木犀草素，禍旋震蕩混勻5 min，后續(xù)過程與對照組一致。具體劑量添加如表1所示。

表1　淀粉消化反應體系Table 1　Starch digestive system

野菊花黃酮對淀粉消化的抑制率計算公式為：

式中：A0原始淀粉消化能力，A0=A2-A1；A0′加抑制劑（黃酮）后淀粉消化能力，A0′=A4-A3。

1.3.5　淀粉對野菊花黃酮清除DPPH自由基的影響

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl，DPPH），是一種極其穩(wěn)定的氮中心自由基，在無水乙醇中呈紫色，最大吸收峰在517 nm處，吸光度與濃度呈線性關系，向其中加入自由基清除劑時，可以結(jié)合或代替DPPH自由基，使自由基數(shù)量減少[15]。本研究分別取1 mL不同濃度的野菊花黃酮（終濃度：2.5 μmol/L～125 μmol/L）溶液，加或不加 0.2 mL、300 μmol/L 淀粉，5 min 后，加入 1 mL、2 mmol/L DPPH溶液，混勻后，加入適量無水乙醇，使反應的總體積為5 mL，在室溫下避光放置20 min，在517 nm處測定吸光度。根據(jù)得到樣品對DPPH自由基的清除率[13]。

DPPH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

式中：Ai為黃酮樣液（有無淀粉）與DPPH反應液的吸光度值；Aj為黃酮樣液與無水乙醇反應液的吸光度值；Ac為無水乙醇與DPPH反應液的吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1　淀粉在傳感芯片表面固定的最佳濃度

淀粉固定的濃度對于后續(xù)試驗順利進行是至關重要的。固定濃度太低，傳感器芯片表面沒有被淀粉充分覆蓋，裸露的結(jié)合位點較多，一方面可能會發(fā)生非特異性吸附，另一方面會導致淀粉與野菊花黃酮相互作用不夠完全；若固定濃度太高，樣品會在傳感器芯片表面出現(xiàn)堆積現(xiàn)象，結(jié)合不牢固，同時造成不必要的試劑損失[16-17]。不同濃度淀粉的SPR響應信號曲線見圖2。

圖2　不同濃度淀粉的SPR響應值曲線Fig.2　SPR signal graph of series concentration of starch

如圖2所示，隨著淀粉濃度的增大，SPR響應值也隨之增大，當?shù)矸蹪舛葹?00 μmol/L時，SPR響應值達到249.33 mDeg。濃度超過300 μmol/L，SPR響應值無明顯增長。故本試驗選取300 μmol/L為淀粉在傳感器芯片表面固定的最佳濃度。

2.2　野菊花黃酮與淀粉相互作用的實時動力學分析

在傳感器芯片表面固定好淀粉之后，向流通池通入不同濃度的不同黃酮溶液，進行SPR相互作用檢測。圖3～圖5分別為不同濃度蒙花苷、刺槐素、木犀草素與300μmol/L淀粉相互作用的SPR實時動力學曲線圖。

圖3　淀粉與蒙花苷相互作用的動力學曲線圖Fig.3　SPR kinetic curves of immobilized starch binding buddleoside

圖4　淀粉與刺槐素相互作用的動力學曲線圖Fig.4　SPR kinetic curves of immobilized starch binding acacein

圖5　淀粉與木犀草素相互作用的動力學曲線圖Fig.5　SPR kinetic curves of immobilized starch binding luteolin

可以看出，隨著黃酮濃度的增大，SPR動力學曲線也有明顯的變化。根據(jù)理論1∶1模型可得到蒙花苷、刺槐素和木犀草素與淀粉相互作用的結(jié)合速率（Ka）、解離速率（Kd）和平衡解離常數(shù)（KD）。這些動力學常數(shù)在表2中有詳細給出。圖6為不同濃度情況下，3種黃酮與淀粉相互作用的SPR響應值比較圖，隨著黃酮濃度的增大，它們與淀粉相互作用的SPR響應值也隨之增強，木犀草素與淀粉相互作用能力最強，刺槐素次之，蒙花苷最弱。

表2為通過SPR自帶軟件（version 2.2.0）對動力學曲線進行擬合得到的動力學常數(shù)。

圖6　不同濃度下3種黃酮與淀粉相互作用的SPR響應值比較圖Fig.6　The SPR response of the different concentration of three flavonoids with starch

表2　蒙花苷、刺槐素和木犀草素與淀粉相互作用的動力學參數(shù)Table 2　Kinetic parameters for buddleoside，acacetin and luteolin binding to immobolized starch

由表2可知，蒙花苷、刺槐素和木犀草素與淀粉作用的 KD值分別為 （4.822 4±0.06）、（3.441 3±0.06）、（2.367 6±0.25）mmol/L。如圖1所示，對比木犀草素，發(fā)現(xiàn)蒙花苷和刺槐素B環(huán)的C-5’位缺少一個羥基，并且在C-4’羥基甲氧基化。而蒙花苷結(jié)構與刺槐素結(jié)構相似，但是在A環(huán)C-7位羥基被糖苷取代后，分子大小和極性都增加，結(jié)構轉(zhuǎn)移到非平面上，位阻的增大削弱了蒙花苷與淀粉之間的結(jié)合[18-20]。所以，3種黃酮與淀粉作用的親和力大小為：木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。結(jié)果表明，羥基基團的數(shù)目和位置對于黃酮與淀粉的結(jié)合至關重要。

2.3　野菊花黃酮對淀粉消化的影響

阿卡波糖是一種用于治療糖尿病的新型口服降糖劑，它能減少多糖和蔗糖在腸道內(nèi)分解為葡萄糖，從而減少糖的吸收，達到降低人體餐后血糖水平的效果。圖7為不同濃度下，3種野菊花黃酮以及阿卡波糖對淀粉消化的抑制效果圖。

如圖7所示，阿卡波糖對淀粉消化的抑制能力最強。但是，阿卡波糖使糖類在小腸內(nèi)的分解和吸收受到障礙而停留時間過長，腸道細菌的發(fā)酵會產(chǎn)生更多的氣體，會導致機體產(chǎn)生腹脹、腹痛和腹瀉等不適癥狀[21-23]。因此，被證實相對安全的黃酮類化合物可能是另一種選擇。3種野菊花黃酮對淀粉消化的抑制能力相差不大，隨著黃酮濃度的增大，它們對淀粉消化能力的抑制能力也逐漸增強，并且，抑制能力：木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。當木犀草素的濃度為100 μmol/L時，其對淀粉消化的抑制率為26.7%。

圖7　蒙花苷、刺槐素、木犀草素和阿卡波糖對淀粉消化的抑制效果Fig.7　The inhibition effect of buddleoside，acacetin，luteolin and acarbose on starch digestion

2.4　淀粉對野菊花黃酮清除DPPH自由基的影響

黃酮類化合物大多具有較高的抗氧化活性[24]。本試驗采用DPPH自由基清除法評價了3種野菊花黃酮與淀粉相互作用后，黃酮抗氧化能力的變化情況。表3為淀粉對3種黃酮清除DPPH自由基的抑制作用。

表3　淀粉對3種黃酮清除DPPH自由基的抑制作用Table 3　Inhibition of starch on scavenging DPPH·capacity of three flavonoids

由表3所示，比較3種野菊花黃酮清除DPPH自由基的半抑制率濃度IC50，它們對DPPH自由基有不同程度的清除作用，且木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。在加入一定濃度淀粉溶液之后，發(fā)現(xiàn)3種黃酮清除DPPH自由基的能力下降。并且，淀粉對它們清除DPPH自由基的抑制作用為：木犀草素＞刺槐素＞蒙花苷。這個結(jié)果與2.2、2.3結(jié)果一致，進一步證實了這3種黃酮抗氧化能力與其本身的羥基數(shù)目和位置有關，B環(huán)是黃酮類化合物抗氧化能力的重要活性部位[25]。

3　結(jié)論

利用SPR技術，建立了一種快速、高靈敏的分析方法以實時監(jiān)測3種野菊花黃酮與淀粉的相互作用，獲得了它們相互作用的動力學參數(shù)，木犀草素與淀粉相互作用能力最強，刺槐素次之，蒙花苷最弱，并且初步探討了它們相互作用的構效關系；研究了3種野菊花黃酮對淀粉消化的影響，為野菊花黃酮在富含淀粉類食品中的應用提供了理論依據(jù)；評價了3種野菊花黃酮與淀粉作用后，其抗氧化活性的變化情況。野菊花黃酮與淀粉發(fā)生相互作用后，不僅影響淀粉的消化，同時自身的生物活性也會受到影響。

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